ДЕЛЕНИЯ ЛЕГОГЛОБИНА Советский патент 1972 года по МПК C07K1/36 C07K14/415 C07K1/34 

Изобретение относится к получению гемоглобина корневых клубеньков высших растений - легоглобина. Этот гемопротеид является, вероятно, функциональным аналогом гемоглобина. Кроме того, этот белок непосредственно связан с эффективностью фиксации азота в клубеньках бобовых растений. В виде препарата сохраняющего свои свойства при хранении этот белок никогда не получали.

Известны способы выделения легоглобина из клубеньков растений который заключаются в том, что клубеньки после разрушения экстрагируют водой или буферными растворами (при кислых значениях рН 5,6) центрифугируют и высаливают сульфатом аммония. Исследования проводят с растворами полученного осадка легоглобина после удаления сульфата аммония путем диализа.

Однако препараты, полученные известным способом, окисляются природными окислителями в момент выделения, в результате чего не сохраняют своих нативных свойств.

С целью получения устройчивого препарата предлагается применять инертный по отношению к легоглобину адсорбент полимерной природы - капрон. Клубеньки срезают с участком корля, затем разрушают их (получают гомогенат) в присутствии порошка капрона. Полученную массу помешают в буферный раствор рП 7,0 для экстракции легоглобина. Затем центрифугируют. Белки, содержащиеся в центрифугате, высаливают сульфатом аммония.

Легоглобин, осажденный сульфатом аммония, очищают фракционированием на коло,нке, заполненной био-гелем Р-10, уравновешенным 0,01 М Трис-НС1 буфером с рН 7,0.

При этом легоглобин очищается от низкомолекулярных примесей и негеминовых белков.

После фракционирования белок лиофилизируют и получают сухне препараты легоглобина красного цвета, сохраняющие свойства исходного белка и хорошую растворимость в водных буферных растворах в широком диа-, пазоне рП.

Все операции по выделению и очистке белка проводят при рП 7,0, что очень важно, поскольку величина рН, 7, как берется в известных способах, является оптимальной для действия растительных фенолоксидаз и способствует окислению железа в составе гема легоглобина.

Пример. Способ получения препаратов легоглобина из клубеньков люпина. Клубеньки срезают с участком корня во избел ание окисления легоглобина на поверхности раны. Гомогенат получают в кофейной мельнице с пластмассовым резервуаром типа КМ-2. Разрушают клубеньки в течение 10-15 сек в присутствии порошка капрона, который добавляют в количестве 25-80% от веса клубеньков. Полученную массу быстро перекладывают в раствор 0,02 М Трис-НС1 буфера с рН 7,0 для экстракции легоглобина. Через 20 мин гомогенат отжимают через полотно и экстракт центрифугируют 25 мин при 23000 g.

Белки, содержащиеся в центрифугате, высаживают сульфатом аммония. При этом фракцию, полученную при насыщении сульфатом аммония от О до 55%, отбрасывают. Фракцию с 55-80% насыщения растворяют в небольщом количестве воды и наносят на колонку с био-гелем Р-10, уравновещенным 0,01 М Трис-НС1 буфером до рН 7,0.

При фракционировании на био-геле Р-10 отделяется значительная по количеству белка фракция, не содержащая легоглобин. Легоглобин элюирзют с колонки количественно в составе фракции И и проявляют его спектрофотометрически. Последнюю фракцию собирают, быстро замораживают и лиофилизируют.

Выход легоглобина количественный.

Растворы легоглобина обнаруживают полосы поглощения характерные для гемоглобинов в видимой области спектра при 412, 543, 572 ммк. и слабую полосу при 630 ммк. При переводе легоглобина в пиридингемохром в спектре обнаруживают полосы поглощения

нри 558 и 526 ммк. Для СО-производных наблюдают полосы поглощения при 542 и 567 ммк.

В препарате легоглобина найдено 0,33% железа и 3,8% гема.

Негаминовое железо не обнаружено.

При пропускании через раствор легоглобипа чистого кислорода, а также при стоянии на воздухе легоглобин оксигенируется.

Предлагаемый способ получения легоглобина прост и эффективен, так как позволяет получать значительное количество легоглобина, не потерявщего своих основных свойств после лиофилизации. Получение лиофилизированных, хорощо сохраняющихся препаратов легоглобина позволяет проводить исследования независимо от вегетационного сезона.

Предмет изобретения

Способ выделения легоглобина из клубеньков бобовых растений путем разрущения их, экстрагирования буферным раствором, центрифугирования и высаливания сульфатом аммоння, отличающийся тем, что, с целью получения устойчивого препарата, разрушение клубеньков проводят в присутствии капрона, полученный высаливанием целевой продукт очищают на био-геле Р-10, и ведут процесс

при рН 7,0.