Способ получения пигмент-белкового комплекса из растений Советский патент 1982 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к способам вьщеления биологических функций и может быть применено в биохимии, сельском хозяйстве, фитопатологии, растениеводстве. Известен способ вьоделения пигменТ-белкового комплекса (ПЕК) из растений путем гомогенизации растительной массы с трис-НС1-буфером и детергентом с последующей очистко дифференциальным центрифугированием и гель-электрофорезом О- Способ имеет следующие недостатки: длительность; нестабильность це левого продукта; необходимость использования большого количества рас тительной массы. Известен также способ получения ПБК путем гомогенизирования растительно|й массы в смеси с трициновым буферам при рН 8,5, последующей обработки сульфатом аммония, диффере циальным центрифугированием при 16000g в течение 60 мин, ресуспенди рования осадка, центрифугирования при 20000g в течение 90 мин и после дующей очисткой ПБК гельфильтрацией Недостатки способа - длительност , (выделение ПБК занимает 18-19 час); громоздкость} кроме того, в известном способе высокое разбавление це- левого продукта. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа получения ПБК из растений, обладаюр1его-ВЫСОКОЙ фотоактивностью. Эта цель достигается тем, что растительную массу гомогенизируют в среде следующего состава, Bec.%t 6,84-13,68 Сахароза 0,009-0,028 Магний хлористый Натриевая соль этилендиаминтетра0,027-0,067 уксусной кислоты 0,05-0,1 Тритон Х-100 10-30 Глицерин Трис-HGl-буфер Остальное Кроме того, растительную массу берут в соотношении к среде выделения 1:1, а последующее центрифугирование проводят при 49000-510OOg в течение 25-35 мин. Предлагаемый способ занимает 6-7 ч, не требует большого количества растительной массы (не более Ii6-20 г), не громоздок, целевой продукт обладает стабильностью и высокой фотоактивностью.

Пример, Берут 18 г охлажденной растительной массы, растирают в среде выделения состава, вес.% Сахароза6,84

Магний хлористый 0,009 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027 Тритон Х-1000,05

Глицерин10

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогейат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 49000g 25 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 X 3,0 см,, скорость тока 0,5 шт/ми объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции, содержащие ПБК, объединяют и для дальнейшей очистки пропускают через колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 X 3,2 см, скорость тока 0,5 глп/мин, объем фракций 5 мл).

В качестве элюирующего раствора используют трис-НС1-буфер, 0,6%, рН 8,4, содержащий 1, КС1. В процессе очистки препаратов температуру колонок поддерживают при0 с помощью охлаждающей рубашки.

Все операции проводят на слабом зеленом свету при .

Добавляют глицерин до 45% (по весу от среды выделения), получают стабильный фотоактивный ПБК, который хранят при несколько недель, фотоактивность при этом не теряется. П р и м е р 2. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растирают в среде вьщеления состава, вес.%: Сахароза 13,68 . Магний хлористый 0,028 Натриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислоты0,067

Тритон Х-1000,1

Глицерин30

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 51000g 35 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения .очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 X 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/ми объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракциях определ5пот, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов.

Затем фракции, содержание ПБК, объединяют и для дальнейшей очистки

пропускают через колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 х 3,2 с скорость тока 0,5 мл/минобъем фракций 5 мл). В качестве элюирующего раствора используют 0,6%-ный трис-НС1-буфер, рН 9,0, содержащий 1,4% КС1.

В процессе очистки препаратов т емпературу колонок поддерживают при О- с помощью охлаждающей рубашки. Все операции, связанные с получением ПБК, проводят на слабом зеленом свету при 0-4С.

Добавляют глицерин до 55вес.% от среды выделения. Получают стабильный фотоактивный ПБК, который хранят при несколько недель, фотоактивность при этом не теряется.

П р и м е р 3. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растирают в среде выделения состава, вес.%: Сахароза10,26

Магний хлористый 0,019 Натриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислоты0,033

Тритон Х-1000,06

Глицерин20

Трис-НС1-буфер Остальное Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при 50000g 30 мин.

Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки 35 х 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракции 5 мл) .

Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции содержащие ПБК, объединяют и для .дальнейшей очистки пропускают через колонку с сефадексом-С-200 (размер колонки 20 X 3,2 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл). В кчестве э.шоирующего раствора используют 0,6%-ный трис-НС1-буфер, рН 8,6,. содержащий 1,4% КС1. В процессе очиски препаратов температуру колонок поддерживают при с помощью охлаждающей рубашки.

Сбор материала и все операции, свзанные с получением ПБК, проводят на слабом зеленом свету при температуре

P-tfc.

Добавляют глицерин до 50 вес.% от среды выделения.

Получают стабильный фотоактивньтй ПБК, который хранят при -18°С. несколько недель. Фотоактивность при этом не теряется.

Фоомула изобретения 1, Способ получения пигмент-белкового комплекса из растений, включаюций гомогенизирование растительной массы с добавлением буфера, фильтрование, центрифугирование и очистку при низкой температуре пропусканием через колонки с сефадексом, концентрирование с последующим добавлением глицерина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, гомогенизирование проводят в среде выделения состава, вес.%1 Cajjapoaa 6,84-13,63 Магний хлористьй 0,009-0,028 Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты0,027-0,067 Тритор Х-100 0,05-0,1 Глицерин10-30 Трис-НС1-буфер Остальное

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что растительную массу берут в соотношении к среде выделения 1:1- 1:1,3, а последующее 1хентрифугирование проводят при 49000-51000g в течение 25-35 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.0га. D. Canaaris. Analysis of the Subunit Srtucture of Protochlorophyllide Holochrome by Sodiiun Dodecyl Sulphate-Polyocrilamide Electrophoresis. Plant-Physiology 60, 422-429, 1977.

2. H6nningzen K. W., Kahn A. Photoactive Subunits of Protochlorophillide Holochrome. Plaut-Physiology 47, 685-690, 1971.