СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГЛЮТАМИНАЗЫ Советский патент 1973 года по МПК A61K38/43 

1

Изо15ретение ютно сится к области медицины.

Известен способ получения L-тлютаминазы путем обработки клеток продуцента ацетоном с последующей экстракцией БОДОЙ и выделением фермента из экстракта фракциовированием органическими растворителями.

Целью изобретения является расширение источниК01В получения фермента.

Достигается это тем, что в качестве лродуцанта используют штамм АТСС 13985 Pseudomonas aureo.fac.iens.

Пример 1. Выращенную при температуре 30°С скощенную а:гар1овую культуру из Pseudotnonas aureofaciens АТСС 13985 смывают 4,0 см 0,9%-ного |Стерильного раствора NaCl. 100 см стерильного 2%-ного (по весу) фильтрованного до (прозрачности растворя кукурузы в замочной воде (рН 7,0) заражают 2,0 см полученной суспензии, содержащей бактерии, и выдерживают в колбе Эрленмейера объемом 1 л в течение 8 час при температуре 30°С на мащине для встряхивания. Полученная таким образом культура, выращенная на качалке, служит в качест1ве заяравочиого материала для ферментных культур.

Затем берут 8 л питательного растовора (на водоправюдной воде) следующего состава (г):

L-глютаминавая кислота 64, глицерин 48, молочиая кислота 24, К2НР04 9,2, КН2РО4 5,05, MgSO4 1,12, FeS04 0,048, MnSO4 0,048, NaCl 0,048. С ломощью 1 н. натрового щелока доводят значение рН до 7,0, стерилизуют ь стеклянном ферментере емкостью IQ л в течение 30 мин П1ри 115°С, и 1после охлаждения заражают 25 см 1выращенной на качалке культуры Pseudomonas aureofaciens АТСС 13985.

Ферментационную исходную смесь подвергают аэрации при температуре 30°С четырьмя литрами воздуха в минуту при скорости вращения мещалки 200 об/мин. Через 5-6 час значение рН ферментной культуры меняется с

7,0 на 7,5. В течение дальнейщих 14 час в растущую культуру (ВВОДЯТ 1,5 л/мин углекислого газа (С02), в результате чего значение рН повыщается до 8,0. Активность L-глютаминазы культурного раствора составляет 8,3 ед/см.

Клетки бактерий центрифугируют, затем из куяьтурального бульона в дистиллированной воде вторично суспендируют до объема 0,32 л. Для ко-агуляции бактерий суспензию вливают в 8 л ацетона, добавляют затем еще 4 л ацетона, и коагулированному клеточному материалу дают осадиться. Затем оставшийся наверху раствор декантируют, осадок П1ромывают свежим ацетоном и сущат в шакууме

при темперагуре 30°С. При этом получают 36,6 г сухого клеточного материала с активностью 1,-глютаМ иназы 1,63 ед1мг.

Пример 2. К 8 л культурального бульона, полученного как ъ примере1, при энергичБом размешИваиии добавляют 8 л ацетома. Коагулированному клеточному материалу дают осадиться, затем ирозрачный оставшийся наверху раствор декаит ируют, осадок дважды промывают 4 л овежего ацетона и еще раз незначительным количеством ацетона, и затем сушат его в вакууме три температуре 30°С. Получают 39 г сухого клеточного материала с активностью /.-1глютаминазы 1,2 ед/мг.

Пример 3. Получение сырой глютаминазы посредством осаждения ацетоно1М. 1200 г клеточного Материала с 1,6 ед/мг вещества суспендируют в 21 л цитратного буфера со Значением рН 5,0, размешивают в течение 2 час при комнатной температуре и затем, Охлаждая, дентрнфугируют (при 20 000 g. Остающийся H-aiEepxy раствор смешивают с тем же количеством ацетона и вьгпадающий при этом Осадок, после отстаивания в течение 1 час, центрифугируют лри 3000 об/мин, промывают ацетоном и сушат.

Экстракцию клеток повторяют. Выход: 321,2 г или 4,2 ед/мг или 75,2%.

П р е д м е т изобретения

Способ получения L-lглютaминaзы путем обрабопки клеток продуцента а1цет01нам с последующей зкстракцией водой и выделением фермента из эмстракта фракционированием органическими растворителями, отличающийся тем, что, с целью расширения источвиков получения(фермента-, IB Качестве продуцента используют щтамм АТСС 13985 Pseudomonas aureofaciens.