СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ Советский патент 1973 года по МПК C12N9/82 

ИзОбретенле относится к микробиологической промышленности.

Известен способ выделения -аспараг назы вз культуральной жи1дкости, нолученной при ,культивирован.и,и Escherichia соИ, предусматривающлй осажденяе L-аспарагиНазы органическим растворителем, например ацетоном.

Предлагаемый способ позволяет более полно выделить фермент из культуральной жидкости.

Для этого перед осаждением L-асп.араги«азы органическим растворителем производят осаждение клеток Escherichia coli в Виде хлапьев из культуральной жидкости добавлением в нее органического основания с молекулярным весам более 1000 или его соли с последующим отделением -клеток, напр.имер, центрифугированием и экстрагированием водой, а доб-авление органимеокого растворителя осуществляют в полученный экстракт.

В качестве основания можно применять акрамин общей фор.мулы

CONH,(CH2) 6-NHCO-NH (СНг) з-N-

СНя

(СН2)

с молекулярньгм весом выше 1000, который можно получать путем реакции обмена ди-(3амино-га-пропил)-метиламина с гександиизоцианато.м; протамин; гистон; катионоактивный крахмал, полученный путем обменного разложения крахмала с гидрохлоридом Р-ДИалк.иламинаэтилхлорида.

Сущность слосо ба заключается в следующем.

Выр:ащи ают клетки Escherichia coli на питательной среде, содержащей неорганические ионы и смесь из а.м.инокислоты .и пептида в форме клеточных автолизов или протеингидролизов в качестве источника азота, а в качестве источника углерода - соответствующие органические кислоты.

В качестве питательной среды можно использовать за,мочную кукурузную «оду. Хорощие результаты получают, если концентрацию молочной кислоты, содержащейся в замочной кукурузной воде, повыщают и добавочно прибавляют NH 4-ионы. Вместо молочной кислоты могут быть также прилгенены янтарная кислота, фумаровая кислота и.пи L-яблочная кислота. Добавление способных под действие-м Escherichia coli к сбраживанию углеводов, на1пример глюкозы, фружтозы, маннозы, мальтозы, галактозы или аминокислот DL-ъклин, DL-серин, /.-цистеин, L-триптофан и DLнорвадин подавляет синтез, а добавление Lглютаминовой кислоты, /.-аспарагиновой кислоты, DL-аланина и гликоколла способствует синтезу L-ac.na.par,Ha3bi. Как основа для питательных растворов может быть использован дрожжевой экстракт. Хорошие результаты показали следующие иятательные растворы, содержащие, %: I. Воду от замочной кукурузы (в отношении к сухой субстанции) 3,0 Молочнокислый натрий6,0(рН 7,0) (NH4)2S040.20 II. Воду от за.мочки кукурузы (в отношении :К сухой субстанции)3,00 Молочнокислый натрий0,30 L-глюта.миновую кислоту-Na 0,15(рН 7,0) Гликоколл0,15 (MH4)2SO40,20 III. Дрожжевой экстракт2,00 МолочнО:Кислый натрий1,00 (NH4) 25:040,20 Эти питательные растворы засевают культурой с касого агара Escherlchia coli АТСС 9637 И культивируют «а вибрациониой маши«е «коло 20 час при 30° С. Значение рН возрастает за iSTO .время до 8,5-в,9. После окончания выращивания в питательный бульон добавляют органическое основание с 1молекулярным весом свыше 1000 или его соль. ,В результате клетки осаждаются хлопьями -и могут быть легче цеятрифугироваиы. После двойного суспендирования клеток В воде их осаждают снова, добавляя ацетон. При это.м клетйад переводятся в удобную для ;перер:аботки фор.му и так изменяются, что образовавшаяся L-аспараглназа .может быть выделена с водой 1из раствора в следующей ступени. Эта ступень состоит из .повторного отделения центр ифугированием, еще одного двойного суопендироваиия и зкстрации водой. Из этой суспензии добавлением одной из названных органических основ осаждают экстрагированные клетки, нуклеиновые кислоты и балластные протеины и удаляют центрифугироваБие.м. Из отстоявщегося водного раствора Ь-аспара.гиваза может быть осаждена пр.и добавлении большого количества ацетона. Вэдесто ацетона для переведения клеток в другую фор.му и для осаждения L-асцарагнHiasbi могут быть применены также другие смещ.и1вае:мые или только ограничено смешиваемые с водой органические р.астворителИ (.метанол, этанол, изонропанол, метилэтилкетон я д.и.метилсульфокоид). Относительную активность /.-аспарагиназы апределяют следующи м образо;м. 16,0 см питательного .раствора центрифуг.ируют, 1отстоявщийся раствор удаляют. Клетки ба:ктернй повторно суспендируют в дважды дистиллированной воде до объема 15,0 слг. 3,0 см этой суспензии клеток разбавляют 12,0 см дважды дистиллированной во.ды и добавляют 15,0 см 2%-ного раствора L-асцарагина в 1/10 молярном буферном раство.ре фосфата со значением рН 7. Затем добавляют 0,2 см толуола. Изготовленную такиМ образом реа:кционную смесь, которая содержит 1,0% аснарагина и 1/10 и 1/6 нервон.ачально находившегося в питятельно:М растворе концентр а1та клеток бактерий (1/10N или 1/6N), за.крыв |резиновой пробкой, встряхивают в течение 3 час при 30° С. |По истечении этого времен.и смесь в течение 5 мин нагрев-ают до 100° С, снова охлаждают и центрифугируют. ОтстояБш.иЙ1Ся раствор ирименяЕОт для калориметрического определения ЫНз-азота с реактивоМ Неслера iB отношении стандартного раствора а.ммонийсульфата. Пр.и этих условиях опыта от выросших в питательном растворе двух клеток 0,035 до 0,065% N; от выр.осш.их в питательном растворе трех клеток - 0,04%1N (.максимально отщепляемый N при содержании 1,0% L-аспарагина щ .реакционной смеси равен .0,0106% N 1). Чтобы получить значение относительной активности L-аспарагиназы Esoherichla coli умножают калориметрически определенную N-концентрацию на фактор разбавления концентрации находящихся с опытной реакционной смеси клеток бактерий. Относительная активность аспарагиназы выращенных клеток в питательно.м растворе I составляет 0,0,25 (0,04) X 10 0,25 (0,4); клеток, выращенных в .питательном растворе II - 0,035 (0,065) X Ш 0,35 (0,65); клеток, вы.ращенных в растворе III-0,04 X 6 0,24. Пример 1. 10%-ный раствор замочной К).курузной ВОДЬ из расчета на cyixoe .вещество посредствам 2N раствора КОН устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение 20 мин до 120°С и .после охлаждения осветляют в центр.ифуге с верхним отводом жидкости или фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачного раствора замочной кукурузной воды .разбавляют водопроводной водой iB количестве 170 л. Для изготовления питательного раствора I добавляют 1,2 кг лактата «атрия и 0,4 кг сульфата а.ммония, для изготовле.ния питательного раствора II добавляют 0,6 кг лактата натрия, 0,3 кг /--глюта1м.ино1вой кислоты-Na, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата ам.мония. Полученный питательный раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110° С, затем охлаждают и инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при 30° С, .и встряхивании культуры Escherichia coll АТСС 9637 в питательном растворе с рН 7,0, состо ящем ,из 1,5% экстракта дрожжей и 0,5%. лактата натрия. Ферментационный затор при 30°С аэрируют воздухом со С|Коростью 80 л1мин при 150 об/мин 1мешалки. По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда рН культуры повысился ирибдизительно до 8,8, .культуральны.й -бульон охлаждают примерно до 20° С. Бактерии, котОрые содержат /--аспарагалазу, коагул ируют, добавляя 4 л 2,5%-ного раствора акр,ИМина R, имеющего формулу

CONH (СНз) 6-NiHCO-NH (СНг) 3-N -

СН,

- (СН2)б

с .молекулярНым весом выше 1000, который 01бразуется ,при. реа1КциИ обменного pa3vio Keлвя ди-(3-а,мино-/г-1пр.оП:ил)--мет ла.М|И1Н:а с ге ксанди.изоц,ианатом; затем отделяют в центрН (фуге с верхним отводом жидкости и повторно суспендируют, добавляя водопрсводную воду до общего объема 20 л.

;В полученную суспензию клеток, размешивая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 слг 2,5%;-ного акра1МиНа R, отделяют выпавшие бактерйл в центрифуге с верхаим отводом жидкости я клеточную массу повторно суспендируют в Водапроводной воде, добав.ляя ее до общего объема 20 л.

Для экстракцИИ лз клеток бактерий L-acпарагин азы суспензию размешивают в течение 4,5 час ;пр,и 30° С. В течение этого времени посредством добавки IN натронного щелока iHviM 1-0%-ной уксусной кислоты поддерживают piH на значепид 7,5-7,8. Затем охлаждают до 20° С.

В экстрагированную клеточную суспензию, разчмещивая, вливают 5 л 2,5%-ного акрамина R ,и отделяют в центрифуге с верхни.м отводом жидкости образовавшийся сильный осадок, состоящий из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основания -комплекса нуклеиновой кислоты и протеина. Осадок выбрасьивают. Получают приблизительно 17 л лрозр.ачного раствора, в котором с другими содерж.ащИМИся в клетках материалами находится Ь-аспараг,и«аза.

Из -полученного раствора, добавляя 68 л ацетона, осаждают сырую L-acn.aparHHa3y. Образовавшийся осадок изолируют, промывают ацетоно,м и просушивают в вакууме при 25-30° С. Получают приблиз1И:тельно 100 г сырой L-ас арагиназы с активностью приблизительно. 3,3 (при применении питательного раствора I) .или 4,0-5,5 ин. ед. .на 1 мг (при применении питательно.го раствора II). При применении питательного раствора III сырая L-аспарагиназа со.держит приблизительно 2,:5 ин. ед. на 1 мг.

Пр.ИМер 2. Катионоактивпый крах.мал является 1высокомолекулярны,м .продуктом с молекулярным весом свыше 1000, который образуется при реакции обменного разложения крахмала с .гидрохлоридом р-диалкила.Мгиноэтил .

10%:-ной раствор замочной кукурузной воды (.из расчета на сухое вещество.) посредством 2N раствора едкого калия устанавливают на .значение рП 7, нагревают 20 мин до

120° С и после охлаждения осветляют в центрИ(фуге с верхним отв-одам жидкости или .фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачно.го раствора замочной ку.курузной 5 воды разбавляют 170 л водопроводной воды. Для ИЗГОТОВЛ6Н.ИЯ питательного раствора I дабавляют 1,2 кг лактата натрия и 0,4 кг сульфата аммовия, для изготовления питательного раствора II добавл-яют 0,6 кг лакта0 та патрия 0,3 кг 1-тлютамино вой кислОты-,Ка, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммония. Полученный питательный р аствор стерилизуют в ферментаторе 40 лшн при 110° С, затем .охлаждают и инокулируют 500 с выросшей

в течение 18 час при 30° С, и встряхивании культуры Escherichia соЦ ATCiC 9637 при значении рП 7,0, состоящем из 1,5% экстракта дрожжей и 0,5% ла.ктата натрия.

Ферментационный затор при температуре

30° С, аэрируют воздухом со скоростью 80 л1мин лри 150 об1мин мешал;к,и.

По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда рН культуры повысился прибл1Изительно до 8,8 культур а лъньш бульон охлаж дают пр.име|рно до 20°С. Бактерии, осоторые содержат 1-аспарагина.зу, коагулируют посредством добавки 2 л 2,5%-ного раствора кати оно активного .крахмала, отделяют в центрифуге с верхним ОТВОД01М жидкости и повторно суспендируют, добавляя водопроводную воду до общего объема 20 л.

В полученную суспенаию клеток, ра.змеш,ивая, вливают 80 л ацетона, добавляют 20 см 2,5% -ного раствора катионоактивного крах |мала, отделяют выпавшие бактер.ии в центрифуге с верхним отводом жидкости и клеточную массу повторно суспендируют щ водопроводной воде, добавляя ее до общего объема 20 л.

Для экстракции из клеток бактерий L-aonaрагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при 30° С. В течение этого Времени посредством добавки IN нат.ронного щелока или 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН 7,5-7,8. Затем охлаждают до 20° С.

В экстрагирова.нную клеточную суспензию, размешивая, вливают 5 л 2,5%-ного катионоактивного крахмала и отделяют в центрифуге

с ве,рхним отводом жидкости образовавщийся сильный осадок, состоящий из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основания - комплекса нук:леиновой кислоты « протеина. Осадок выбрасывают. Получают приблизительно 17 л прозрачного раствора, в Котором наряду с другими содерл аЩ.имися в клетках матерналами находится L-acnap.arHHa3a.

Из по.тученноГО раствора, добавляя 68 л ацетона, осаждают сырую L-аспарагиназу.

0 Образова.вщийся осадок .изол нруют, промывают ацетоном ,и просушивают в вакууме при 26 до .30° С. |Получают приблизительно 100 г сырой L-acn.aparnHa3bi с активностью приблизительно 3,0 (при применении питательного

5 раствора I) или 4,0-4,5 ин. ед. на 1 мг (при

прямен-ении литательного раствора II). При применении литательного раствора III сырая Ь-асиаратинаЗа содержит приблизительно 2,5 ин. бд. на 1 яг.

Пр.имер 3. 10%-:ный раствор замочной кукурузной воды (,иа расчета на сухоте вещество) посредством 2N раствора едкото калия ус т а На в Ли в а ют иа значение рН 7, нагрев,ают в течение 20 ми.н до 120° С и лосле охлаждения осветляют В центри фуге с BepiXBHM отводо-м жидкости .ил:И (фильтрованием .методом Зейтца. 3€ л этого лрозрачяого раствора замочной .кукурузной воды разбавляют 170 л водолроВОДИОЙ 1ВОДЬГ.

Для .изготовления литательного раствора I добавляют 1,2 кг лактата .натрия « 0,4 кг сулыфата аммония.

Для .изготовления литательного раствора И добавляют 0,6 KiS лактата натрия, 0,3 кг -глют1ам:иноеой кислоты-Na 0,3 кг глвкоколла и 0,4 КЗ сульфата аммония.

Полученный питательный pacTBiOp стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110° С, затем охлаждают и и-нокулируют 500 СМ вы1рО1Сшей в течение 18 час лря 30° С, ,и встряхвваиии культуры Esoherichia colt АТСС 9637 пря зн.ачени1И. рН 7,,0, состоящем 1,5% экстракта дрожжей и 0,5% лактата «атрия. Ферментационный затор при 30° С аэрируют воздухом со скоростью 80 л/мин при скорости вр.ащеаия М1е,шал;ки 150 об/мин.

По истечении времени роста lOT 16 до 18 4aCj ко1гда .рН культуры повысился приблизительно до 8,8, 1культуральный бульон охлаждают лр1И.мерно до 20° С. Бактерии, которые содержат Ь-асиарагиназу, коагулируют посредством добавки 1 л 2,5%-ного раствора основания

{-iNiH-(€«2)з-N-.{СН2)з-NH - (СН2)

I СНз

с .молекулярньш весом свыше 1000, который образуется лри реакции обм.енното р-азложения ди- 3-а;мино-«-лр1ап. метила мина с эпихл.0 ргидр:ином; отделяют в |Це1Нтрифуге с верх«ИМ отводом ж.идкО|СТ,и. и повторно суспендируют, добавляя водолроводную воду до ci6щего объема 20 л.

Для экстра1К ци1и из .клеток бактерий L-acпарагиназы лолученную суспензию размешивают в течение 4,5 час лр.и 30°-С. .В течение этого времени, посредством IN .натрониого щелока или 10%-ной.укоусной кислоты п.ад.де,рживают рН «а зйачеиии 7,5-7,.8. Затем охлаждают до 20°С.

В экстрагироваиную клеточную суапенз.ию, раЗ|Меш.ивая, вливают 2,5 л 2,5%-но.г.о раствора основания и отделяют в .центрифуге с верхним ОТВОДО.М жидкости о бразовавщи.йся сильный осадок, состоящий из экстра.пированных бактерий и .нераствори.мого .оснав1ания-ком.плекса нукле.И1Новой кислоты и лротеила. Осадок выб.расывают. П.олуЧ|ают .приблизительно 17 л л.розрачного раств., в котором наряду с другими саде,ржащ1ИМися в .клетках матер.иалами находится .-асларагиназа.

Из полученного раствора посредством добавки 69 л а.цетона, осаждают L-аспарагиназу. Образовавшийся осадок изолируют, лро.мывают ацетоНом и .просушивают в .ва1сууме 1пр.и 25-30° С. Получают лриблизительно 100 г сырой L-аспарагиназы с а|Кт.и.вностью приблизительно 3,3 (пр.и лрименении питательного р.аствора I) или 4,0-4,6 .ин. ед. на 1 мг (.пр.и пр.именении питательного раствора II). При применении питательн.о.го раствора 1П сырая L-аспарагиназа содержит лрибли.з.ительно 2,5 ин. ед. на 1 мг.

Предмет и з .о б р е т е н и я

Способ выделения /.-асп.арагИ|Назы из культуральной 1Ж.идкости, лолученной лри культи.вирова.нии Escherichia coli, предус.матривающий Осаждение /.-аспаратиназы ор.Г1аиически.м .растворителем, на.при.мер 1ацет|0.н.ом, отличающийся TeiM, что, с целью б.олее полного выделен.ия .фермента, перед осаждевием L-acnapaли.назы орган.ически.м растворителем, .производят осаждение клеток Escherichia coli в виде хлопьев .из культу.ралыной жидкости добавлением в нее органического основания с молекулярньим весо.м более 1000 ил.и его соли с лоследующи.м отделением клето.к, например, центр.ифугирован.ием и экстрагированием воДО.Й, а до бавление органического растворителя осуществляют в полученный экстракт.