СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА В МЯСНЫХ ТКАНЯХ Советский патент 1973 года по МПК G01N33/12 

1

Изобретение относится к мясной промышленности, а именно к способу количественного определения метандростенолона в мясе и субпродуктах.

Известен способ количественного определения гормональных препаратов в мясных тканях путем экстракции препарата из тканей, хроматографической очистки и последующего спектрофотометрического и денситометрического исследования.

Однако известный способ не обеспечивает достаточной точности анализа.

Для устранения этого недостатка в предлагаемом способе перед хроматографической очисткой проводят перераспределение препарата в смеси 70%-ного метанола и гексана, а хроматографическую очистку ведут адсорбционным методом в три стадии, первую из которых осуществляют на колонке окиси алюминия, а вторую и третью - в тонком слое силикагеля.

При этом экстракцию проводят в три стадии хлороформом при 45°С.

Кроме того, для определения препарата в субпродуктах гидролиз ведут методом сольволиза.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Берут 20 г мясной ткани (мышц, печени или почек), измельчают и трижды (по 40 мл при

45°С) экстрагируют хлороформом (100 мл, 50 мл и 50 мл хлороформа соответственно) при постоянном перемещивании на магнитной мешалке. Хлороформные экстракты объединяют и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат промывают 0,1 и. NaOH (1/10 объема) и 2-3 раза дистиллированной водой (1/10 объема) до нейтрального рН, обезвоживают фильтрованием через Na2SO4 и высушивают в вакууме. Сухой экстракт растворяют в 30 мл 70%-ного водного раствора метанола и интенсивно встряхивают в делительной воронке с. S мл гексана. Гексан дважды промывают равным объемом 70%-ного метанола. Объединенные растворы метанола выпаривают в вакууме при 45° С. Водный остаток экстрагируют 3 раза двойным объемом этилацетата. Этилацетатные экстракты выдерживают 10-12 час (2-4°С). Нижний слой

отбрасывают, этилацетат отгоняют в вакууме. Сухой остаток растворяют в 5 жл бензола и наносят на колонку окиси алюминия (адсорбент стандартизован добавлением 10% воды); используют колонки размерами 0,8-7,5 ел.

Последовательность элюции: 10 мл бензола (I фракция); 10 мл 0,5%-ного раствора этанола в бензоле (И фракция); 15 мл 1%-ного раствора этанола в бензоле (П1 фракция); 10 мл 1,5%-ного раствора этанола в бензоле

(IV фракция). Метандростенолон полностью

элюируют 10 мл 1,5%-ного раствора этанола в бензоле (IV фракция), эту фракцию выпаривают в вакууме при 45°С, и приводят тонкослойиую хроматографию иа силикагеле КСК-2 в одной из систем растворителей гексан-этилацетат или циклогексан-этилацетат (с ианесенным стандартом). Слой адсорбента разрезают на 1 см выше и ниже пятна стандарта. Полученные в виде равных по площади прямоугольников участки слоя и два коптрольных пустых участка используют для элюции.

Элюцию проводят 15 мл этанола (30 мин) и 15 мл метанола (30 мин) на магнитной мешалке при 45°С. Затем адсорбент переносят на стеклянный фильтр № 4 и под небольшим вакуумом пропускают смесь этанола и метанола (1:1) до сих пор, пока фильтрат не поглош,ается при К 245 ммк. Объединенные экстракты выпаривают в вакууме, осадок растворяют в 4 мл метанола и определяют оптическую плотность при Я 245 ммк (1-е количественное определение).

После спектрофотометрического исследования метанол выпаривают в вакууме; осадок растворяют в минимальном объеме 30%-ного метанола в бензоле и количественно наносят на пластину силуфола. На пластину также наносятся различные количества стандартного препарата метандростенолона. Хроматографнрование проводят с использованием системы растворителей: циклогексан-этилацетат (1 : 1). Для проявления стероида используют раствор (3 мл на 1 пластину), содержащий концентрированную серную кислоту, ледяную уксусную кислоту, формальдегид, воду в соотношении - 10,6 : 5,0 : 0,5 : 84,5.

Пластину силуфола прогревают под лампой в течение 40 сек трижды с пятиминутным интервалом. Затем пластину выдерживают

30 сек над водяной баней для иросветления фона и прогревают повторно.

Денситометрию пятен проводят в отрал :енном свете, используя экстинкционно-регистрирующнй прибор ERJ 65. Кривые экстинкции экстранолируют по кривым распределения Гаусса и по иптегральной кривой рассчитывают ироцеитиое содерл ание каждого комнонента. Рассчитывают количество метандростенолана с учетом его процентного содержания и количество нанесенного стандарта (2-е количественное определение).

При определении метандростеиолона в субпродуктах перед очисткой препарата проводят гидролиз методом сольволнза.

Предмет изобретения

1. Способ количественного определения гормонального препарата в мясных тканях, преимущественно метандростенолона, путем экстракции препарата из ткани, его хроматографической очистки и последующего спектрофотометрического и денситометрнческого исследования, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, перед хроматографической очисткой препарата проводят его перераспределение в смеси 70%-ного метанола и гексана, а хроматографическую очистку ведут адсорбционным методом в три стадии, первую из которых осуществляют на колонке окиси алюминия, а вторую и третью - в тонком слое на силикагеле.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят в три стадии хлороформом при 45°С.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что для определения препарата в субпродуктах перед очисткой препарата осуществляют его гидролиз методом сольволиза.