1
Изобретение относится к мясной нромышленности, а именно к снособу количественного определения диэтилстильбэстрола в мясе и субпродуктах.
Известен способ количественного определения гормональных препаратов в мясных тканях путем экстракции препарата из тканей, гидролиза, его перераспределения в растворителях, хроматографической очистки и последующего денситометрического исследования.
Однако такой способ не обеспечивает достаточной чувствительности и надежности анализа.
Для устранения указанного недостатка в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в 2 этапа: в поле центробежных сил и на адсорбционной колонне, гидролиз проводят в растворе неорганической кислоты с добавлением растворителя, а хроматографическую очистку ведут последовательно распределительным и адсорбционным методами.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Берут три пробы (по 250 г) мясной ткани (мышц, печени или почек). Экстракцию, гидролиз и первый этап очистки в системе СНС1з-Н20-Ма2СОз-NaOH проводят для каждой из трех проб отдельно. Тщательно измельченную ткань дважды экстрагируют в
центробежном экстракторе 96%-ным этанолом (500 мл). После фильтрования через бумажный фильтр ткань смешивают с равным по весу количеством целита - 545, переносят на
экстракционную колонну (0,8X6,0 см) и вновь экстрагируют 96%-ным этанолом (1000 мл на 250 г ткани). К 1500 мл объединенного этанольного экстракта каждой пробы добавляют 50 мл 2 н. НС1, выпаривают до объема 100-
150 мл и проводят очистку в системе хлороформ-вода-углекислый натрий--гидрат окиси натрия. К гидролизату добавляют 100 мл хлороформа и 300 мл воды. После встряхивания и разделения слоев хлороформную фазу переносят в делительную воронку и промывают 100 мл воды. Экстракцию хлороформом и его промывание повторяют еще дважды (по 50 мл хлороформа). Водные фазы отбрасывают. Хлороформные фазы объединяют и их
дальнейшую обработку последовательно проводят в трех делительных воронках. Первая воронка содержит 20 мл 10%-ного Ыа2СОз, вторая и третья воронки по 40 мл 1%-ного NaOH. После встряхивания и разделения фаз
СНС1з-слой и Ыа2СОз-слои отбрасывают. Объединенные NaOn слои подкисляют 2 н. НС1 и трижды экстрагируют 30 мл хлороформа. При наличии желтой окраски конечных хлороформных экстрактов обработку в системе
Ма2СОз-NaOH повторяют.
В дальнейшем экстракты трех проб (соответствующей ткани) объединяют и вынаривают в вакууме. Сухой остаток растворяют в 30 мл 70% метанола и интенсивно встряхивают в делительной воронке с 8 мл гексана. Гексан дважды промывают равным объемом 70% метанола и отбрасывают. Метанольные экстракты объединяют и выпаривают в вакууме; водный остаток после подкисления 2 н. НС1 дважды экстрагируют хлороформом (по 30 мл). Водную фазу отбрасывают. Хлороформ обезвоживают, выпаривают до объема 1-2 мл и наносят на колонку силикагеля Л (0,6X8,0 см).Элюированиепроводят
(0,5 мл/мин) 20 мл хлороформа (фракция 1, не содержащая диэтилстильбэстрол) и 30 мл 1 % этанола в хлороформе (фракция 2, содержащая диэтилстильбэстрол). Фракцию 2 выпаривают на роторном испарителе до минимального объема и наносят на пластину силуфола. Хроматографируют в системе растворителей эфир-бензол {i : 4). Пластину силуфола облучают в УФ-свете в течение 30 мин, вырезают полосу хроматограммы (4X15 см) с проявленными пятнами специфического продукта фотохимической реакции - 3,4,5,6,12,13гексагидро-3,6-диоксо - 9,10-диэтилфенантрен; денситометрируют в отраженном свете на экстинкционно-регистрирующем приборе .
При отсутствии условий для денситометрии количественное определение после хроматографии на бумаге (в системе бензол-метанол-вода, 5:7:3) или в тонком слое силикагеля (этанол-бензол, 1 : 9) проводят спектрофотометрическим или флюорометрическим методами. Спектрофотометрически (при Я
910 нм) измеряют (после УФ-облучения в смеси 96%-ный этанол - 1,8%-ной К2НР04, 1:1) окращенный в желтый цвет продукт фотохимической реакции; флюорометрически определяют 3,6-дигидрокси-9,10-диэтилфенантрен (возбуждение флюоресценции при К 360 нм, измерение при , 400 нм).
Предмет изобретения
1.Способ количественного определения гормонального препарата в мясных тканях, например диэтилстильбэстрола, путем экстракции препарата из ткани, гидролиза, перераспределения в растворителях, хроматографической очистки и последующего денситометрического исследования, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и надежности анализа, экстракцию осуществляют в два этапа: вначале в поле центробежных сил, а затем с помощью адсорбции, гидролиз проводят в растворе неорганической кислоты с добавлением растворителя, а хроматографическую очистку ведут последовательно распределительным и адсорбционным методами.
2.Способ по п. I, отличающийся тем, что перераспределение гидролизата проводят последовательно в двух системах растворителей: вначале в системе хлороформ-вода-углекислый натрий-гидрат окиси натрия, а затем в системе метанол-гексан-хлороформ.
3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что денситометрическое исследование
проводят с применением фотохимической реакции.
