Способ получения экстракта абортирующих веществ Советский патент 1979 года по МПК A61K35/78 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА АБОРТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ но не свыше 2-х часов. Полученный ВО.Г.НЫЙ слой затем отделяют от растения и получают окрашенный в темный цвет раствор. /jii fr-SS-ftis . v; : п11ИМенён1й Ор1:а;нк ч:ее 1 :бго pScT ворителя берут равный объем соответ cfTiзyй)Щёгo pacтвopит.eля при экстрагировании водной фазы (температура Шодарагйрования нвскрлько выше, чем комнатная) и доводят до температуры кипения данного растворителя, Экст Загирование органическим растворителем ведут втечение 1-2 ча Органические экстракты соединяют УШетё ; гыпарйва.юТ досуха при температуре, 30-80°С. , Продукт, получаемый при начальной , додержит активную основу и обладает полезнрй биологической активностью, но еще содержит ряд нежелательных примесей. Это вещество очищают. Для этого в качестве исходного бёрут соответствующее количест ™ BO° ea;ecTSa, полученное после водноорганической экстракции, сначала растворяют его и органическом растворителе, полученный раствор фильтруют и промывают водным раствором слабой щелочи, например бикарбоната натрия, карбоната натрия, ацетата , для удаления водорастворимых ; и кислых примесей, предпочтительно применять насыщенный раствор основания. Органический растворитель отгоняют известным способом, а остаток про пускают через колонку с сорбентом. В качестве сорбента используют поли Мерные и сополимерные материалы, например сополимер винилацетата, разЛичные типы силикагеля и окись алюминия . Лучшим сорбентом является сополи мер винилацетата. Обычно собирают несколько фракций в каждой из них определяют биологически активное вещество тонкослойной хроматографией. Однако, где нузкно более чистое вещество,фракции,содержалще активное начал о, собирают вмест и хроматографируют натаком сорбенте как силикагель, флорисил или окись алюминия. Колонку промывают органическим растворителем или смесью растворите лёй. КтШ 11МШСТвОрйТёляМетнос:ят ся ароматические углеводороды., например бензол, толуол, ксилол, и низ шие алифатические эфиры, например ме тйлацетат, этилацетат, бутилацетат, или смеси этих растворителей. Кескол ко фракций собирают и активное начал снова прослеживают тонкослойной хроматографией. Фракции, содержащие нуж ное вещество, соединяют вместе, растворитель отгоняют и получают абортир ющее вещество. Полуочищенный экстракт, полученный при начальной очистке, можно дальше очистить хроматографированием на таком сорбенте, как кремниевая кислота, силикагель или флорисил, применяя смесь полярных или неполярны ; растворителей в качестве элюента. Лучшим сорбентом является кремниевая кислота, можно применять нейтральную или кислую кремниевую кислоту. Вещество для хроматографирования лучше сначала растворять в соответствующем растворителе, например хлороформе, затем его вводят в колонку с сорбентом в соответствующем растйорителе и колонку элюируют смесью полярного и неполярного растворителя. кполярным растворителям относятся низшие алкильные спирты, например этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, низшие алкильные эфиры, например этилацетат, бутилацетат, алифатические кетоны, например ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, К неполярныМ| растворителям относятся хлорированные углеводороды, например хлороформ, углеводрродные растворители, например пентан, гексан, гептан, ароматические углеводороды, например бензол, толуол. Лучшей смесью растворителей является изопропанол - хлороформ. Собранные фракции выпаривают досуха при температуре от комнатной до 40с. Состав собранных фракций прослеживается Тонкослойной хроматографией, но раствор сырого экстракта хроматографируют также без отгонки растворителя, В результате очистки получают абортирующее вещество, содержащее не менее трех основных компонентов в смеси, что доказывает хроматография. Наличие абортирующих веществ в смеси определяют по методикам, применяемым для обнаружения сокращений матки и прерывания беременности у животных самок. Прерывание беременности у морских свинок наблюдается при введении смеси в дозах 75-100 мг/кг. Сокращение матки- обнаруживается при введении 2,5-5,0 мг/кг смеси. Очищенное абортирующее вещество выделяют из экстракта дополнительной очисткой. Для этого исходные экстракты, из которых получают очищенное абортирующее вещество, получают из растения серией экстракций и очисток, Листья сначала суспендируют в воде и.смесь нагревают до 98-100°С в течение нескольких часов. Горячую смесь фильтруют и; Остаток на фильтре промывают горячей водой. Смесь фильтруют второй раз и фильтраты смешивают. Смешанные водные экстракты несколько раз экстрагируют органическим растворителем. После разделения водного и неводного слоя органический растворитель удаляют известным способом Соответствующими растворителямй7 ля органической экстракции.являются не смешивающиеся с водой органические алифатические эфиры, например этилацетат, и бутилацетат, алифатические углеводороды, например хлороформ, четыреххлористый углерод и метиленхлорид, ароматические углеводороды, например бензол или толуол .,водонесмешивающиеся алифатические спирты, например бутанол, пентанол, гексано Предпочтительным является этилацета Остаток после удаления органическог растворителя несколько раз экстраги руют горячим органическим растворителем. Растворитель снова удаляют и остаток промывают горячим органическим растворителем, В качестве дополнительной очистки остаток растворяют в соответствующем растворителе, например ацетоне, и перемеши,вают с сорбентом, например древесным углем. Остаток после фильтрования и уда ления растворителя применяют в качестве исходного вещества, из которого получают очищенные абортирующи вещества. Абортирующие свойства этих вещес определяют по измерению степени сокр щения .матки и степенью прерывания бе ременности у животных самок. При желании небольшие примеси удаляют из очищенного соединения дальнейшим хро матографированием на сорбентах, например кремниевой кислоте или флорисиле. Колонку элюируют органическим растворителем или смесью растворителей, лучшей является хлороформ - изо пропанол, состав собранных фракций определяют тонкослойной хроматографией. Очищенные абортирующие вещества эффективны при введении дозами от 1,0 мг до 100 мг/кг. Необходимая доз зависит от вида животного, которому вводят вещество. Вещество может быть приготовлено в качестве раствора, суспензии и твердой формы, Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1, Экстрагирование листьев органическим растворителей с последующей водной экстракцией органического слоя 2,0 кг сухих листьев кипятят с обратной перегонкой в снеВ,в течение 1 часа. После филъ рования хлороформный экстракт выпаривают досуха при пониженн.ом давлёнии и температуре 35-50°С и получают 196 г темной полутвердой массы. Этот остаток экстрагируют горячей смесью этанол - вода (1:2). Водно-этанольную фазу снова экстрагируют СНСЙд, хлороформный слой отделяются выпаривайт досуха при пониженном давлении, получают желтокоричневый сироп. Его растворяют в эфире и раствор промывают водным насыщенным раствором бикарбоната натрия, 5%-ным раствором едкого натрия, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. После испарения эфира остается сырой экстракт в виде желтого масла (11,9 г), П р и м е р ,2, Водная экстракция листьев с последующей экстракцией водного слоя органическим растворителем, 634 г,сухих листьев кипятят с обратной перегонкой с 4,0 л воды в течение 1 часа. Экстракт декантируют и экстрагируют хлороформом. Хлороформную фазу сушат и фильтруют, растворитель отгоняют при пониженном давлении., остается 4,55 г полутвердой массы. Водную фазу снова экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, выпаривают при пониженном давлении и получают 1,99 г. Оба остатка от хлороформа и этилацетата смешивают и получают экстракт. Пример 3, Водная экстракция листьев с последующей экстракцией ВОДНОГО слоя этилацетатом, 140 г сухих листьев растения рода Зоепетл и 2,5 л воды нагревают с обратной перегонкой в течение 1 часа. Водный экстракт упаривают до объема 250 мл и экстрагируют 4 раза по 750мл этилацетата. Экстракты смешивают и сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и отгонки растворителя в вакууме получают 1,3 г темноокрашенной массы. Ее экстрагируют 100 мл хлороформа, фильтруют, выпаривают в вакууме и получают сырой остаток в количестве 0,840 г. Пример 4, Экстракция листьев гексаном, , 966 г сухих листьев растения рода Зоепетл нагревают с обратной перегонкой в течение 3 час с таким количеством гексана, чтобы листья были полностью закрыты. После фильтрования и выпаривания полученной жидкости досуха получают 56,8 г темного зеленоватого сырого экстракта. Пример 5, Экстракция гексаном с послёЛХ ЙЩей экстракцией органического слоя водой и с последующей экстракцией водного слоя этилацетатом, 350 г сухих, листьев растения рода Зоепетл покрывают слоем гексана и эту смесь нагревают до начала кипения в течение 15-20 мин при перемешивании. Гексановый экстракт декантируют, фильтруют и обрабатывают равным объемом воды (около 700 мл). Слои разделяют и гексановый слой снова обрабатывают равным объемом воды при перемешивании. После разделения слоев гё сановую фазу обрабатывают таким образом еще раз. 6 Водные слои смешивают и три раза экстрагируют равным объемом этилацетата. Этилацетатные экстракты смешивают и выпаривают досуха, получают 6,6 г сырого экстракта в виде темного коричнево-желтого сиропа. Пример 6, Водная экстракция листьев с последующей экстракцией активного вещества бензолом, 1кг сухих листьев растения рода Зоепетл нагревают с 15 л воды в течение 3 час с обратной перегонко при давлении 586 мм рт,ст. Водный слой декантируют и фильтруют через сетку. Затем его обрабатывают 700 г активированного угля до наступления флоккуляцрти. Затем смесь перемешиваю в течение 2 час, быстро фильтруют в вакууме и получают прозрачный филь трат. Отфильтрованное твердое вещест во сушат в вакууме при комнатной тем пературе в течение 3 дней, затем суспендируют в 3 л бензола. При отгонке бензола отгоняется около 200 м воды,, получают бензольный слой, кото рый при упаривании досуха дает З г сырого экстракта в виде масла. Пример 7. Водная экстракция листьев с последующей экстракцией, водного слоя этилацетатом. 2кг свежих листьев растения рода Зоепетл покрывают слоем воды (10-12 л) и кипятят в течение 1 часа Затем смесь фильтруют через сырую ткань в горячем состоянии и дают остыть. Водную часть дважды экстрагиру ют двойными объемами этилацетата. За тем этилацетатную вытяжку выпаривают досуха при в вйкууме и получают 12 г темно-зеленой массы. Эту массу обрабатывают 500 мл бензола и смесь нагревают до кипения в течение 15 мин. Бензольный слой декантируют, остаток промь1вают бензолом до прекра щения экстрагирования вещества. Бензольные экстракты сме1яивают и выпаривают досуха в вакууме при , Получают коричневатую массу, которую затем последовательно экстрагируют отдельными порциями гексана до получения бесцветного гексана. Полученны остаток, около 8 г, имеет консистенцию густого сиропа. Это вещество растворяют в ацетоне (100 мл или меньше) и добавляют 5 г активированного УГЛЯ. Смесь перемешивают при комнатной температуре 1 час до флоккуляции угля. Смесь фильтруют, фильтрат выпаривают досуха в вакууме при слабом нагревании () и получают 4-6 г cHpofo экстракта. Пример 8. Сырой экстракт из примера 7 (4,33 г) растворяют в эфире (500 мл) и полученный раствор фильтруют и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл), Эфир сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, выпари8вают досуха и получают светло-желтое масло (3,4 г).. Затем это масло растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку, снабженную набивкой из 2 кг винилацетатного сополимера. Колонку элюируют бензолом и собиргиот следующие фракции после отгонки раствориЬеля. Об-ьем (л) Остаток (г) Фракция Вещество из ракции №3 (1,1 г) растворяют в бензоле (10 мл} и раствор добавляют в колонку с сухим силикагелем (60 г), размером 1м х х2 см.Колонку элюируют смесью бензола и этилацетата 4:1. После отбора фракций по 125 мл каждая элюирующую смесь изменяют на бензол-этилацетат 1:1. Нужное вещество в фракциях 28-31 определяют тонкослойной хроматографией. После отгонки растворителя из фракции 28 получают 0,046 г полу- очищенного вещества. Фракции 29-31 растворяют в хлороформе, остаток наносят на 5 препаративных пластинок для тонкослойной хроматографии и пластинки проявляют б раз бензолом и 3 раза смесью бензол-этилацетат 4:1. Основную полосу отделяют и элюируют этилацетатом. Растворитель отгоняют и получают полуочищенное вещество. Пример 9. Сырой экстракт из примера 7 (4,5 г) растворяют в эфире (50 мл), раствор фильтруют и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл). Эфирный раствор сушат над сульфатом натрия и выпаривают досуха. Полученный остаток (3,6 г) растворяют в хлороформе (25 мл) и загружают в колонку с нейтральным силикагелем в хлороформе. Колонку элюируют хлороформом и смесями хлороформ-изопропанол и собирают фракции по 25 мл. Пять таких фракций по 25 мл смешивают и получают одну фракцию в 125 мл. Собирают около 75 таких фракций по 125 мл и выпаривают досуха в вакууме при температуре ниже 40с. Колонку элюируют следующим обраФракции по 125 мл 1-18 Хлороформ 19-30 Изопропанол:Хлороформ(1:99) 31-44 то же то же (1:49) Фракции контролируют тонкослойной хроматографией как в примере 8. На основе данных тонкослойной хроматографии фракции 49-66 смешивают, отго няют растворитель и получают маслянистый остаток. Остаток затем очищают нанесением на силикаг елевыё ripeпаративные пластинки для тонкослойной хроматографии,Пластинки проявляю смесью изопропанол-хлороформ (2:23), основную полосу элюируют и выпари-, вают, получают остаток (540 мг). Часть этого вещества весом 400 мг хроматографируют таким же образом и получают полуочшценное веществоВ виде масла. Пример 10. Сырой экстракт из примера 7(1 г) осторожно смешиваю с эфиром (5 мл) в пробирке. Раствор смешивают с бикарбонатом натрия (2 м смесь центрифугируют и эфир отгоняют Бикарбонатный раствор промывают двум дополнительными порциями, эфира по 2 мл. Эфирные э-кстракты смешивают и растворитель отгоняют. Сухой остаток смешивают с небольшим количество силикагеля, смесь помещают в перед ний конец подготовленной колонки, снаряженной силикагелем. Снаряженную колонку вставляют в прибор для жидкостной хроматографии и колонку элюи руют с градиентом от 2,5 до 7,5% дио сана в гексане при давлении 28 атм. Колонку элюируют 2,5% диоксана в гек сане в течение 30мин, 5% диоксана в гексане в течение 30 мин и 7,5% диоксана в гексане в течение 30 мин. Собранньге фракции контролируют газовой и тонкослойной хроматографией, получают пблуочищенное вещество. пр и м ё р 11. 10 кг листьев рас тения рода Зоепетл и 125 л воды загружают в резервуар из нержавеющей стали с паровой рубашкой емкостью 450 л. Смесь нагревают при 98-100°С в течение 2,5 час при периодическом помешивании. Горячую смесь фильтруют через сетку и получают чай темного цвета в количестве 105 л. Твердый остаток в резервуаре промывают 17л воды и фильтрат смешивают с полученным ранее чаем. Соединенные водные экстракты снова экстрагируют 125 л этилацетата. Смесь сильно пере мешивают и дают отстояться. Верхний . слой сифонируют для разрушения эмульсии и отделяют сколько можно этилацетата. К смеси добавляют еще 90 л этилацетата и повторяют процесс. Соединенные этилацетатные экстракты выпаривают при в вакууме. Остаток экстрагируют тремя порциями горячего (15-80°С} бензола. Бензольные экстракты выпаривают в вакууме при и остаток три раза промывают 8 л кипящего с обратной перегонкой гексана. Промытый гексаном остаток растворяют в 2 л ацетона и добавляют 10 г угля Нухара и смесь перемешивают 1 час при комнатной температуре. Уголь отфильтровывают, .фильтрат отгоняют при 30°С в вакууме и получают 69 г сырого экстракта. Пример 12. Сырой экстракт (50 г), используемый в качестве исходного вещества, растворяют в эфире (5л) и полученный раствор фильтруют и промывают насыщенным pacтвopo бикарбоната натрия (500 мл). Эфир сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, получа ют светло-желтое масло (44,6 г),. Затем масло растворяютВ хлороформе (400 мл) и раствор загружают в колонку с 2,5 кг- нейтральной кремниевой кислоты в хлороформе. Колонку элюируют хлороформом и смесью хлороформизопропанол и собирают ilO фракций. Фракции выпаривают досуха в вакууме при температуре ниже 40°С, Колонку элюируют следующим образом. . Состав фракций контролируют тонкослойной хроматографией (силикагель, изопропанол-хлороформ 1:12,5) и газовой хроматографией. Фракции 78-84 смешивают и растворитель отгоняютв вакууме и получают маслянистый осадок (5,1 г), который содержит не менее трех основных компонентов. Часть осадка (3,2 г) растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку с винилацетатным сополимером в бензоле. Колонку элюируют бензолом и собирают 47 фракций. Для контроля состава фракций применяют тонкослойную и газовую хроматографию. Предлагаемый способ обеспечивает получение абортирующих веществ с высокой активностью. 6 Формула изобретения 1. Способ получения экстракта абортирующих веществ из растений рода Зоепетл путем водного экстр гирования, отличающийся тем, что, с целью повышения активнос ти целевого продукта, экстракт обрабатывают водонесмешивающимся органическим растворителем, осадок отделяют, растворяют в органическом растворителе, обрабатывают пoдJщeлoчeннoй водой, с последующей кроматографией, элюирован.ием смесью полярного и неполярного растворителя, удалением органических растворителей/ хроматографией, элюированием неполярным 12 органическим растворителем и концентрированием. 2.Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве водосмешивающего растворителя применяют ароматический углеводород, хлорированный углеводород или простой алифатический эфир. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя применяют эфир, хлороформ или бензол. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР №259878, кл. Q 07 с 43/00, 1968.