СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПЕПТИДОВ Советский патент 1973 года по МПК C07K14/585 

Изобретение относится к 0:бла1сти получения новых пептидов, обладающих высокой гипокальциемической активностью. Предлагаемый способ позволяет получать по оптимальной .схеме аналоги человеческого тиреокальцитони-на, представляющие собой новые, ранее неизвестные лептиды. Предлагаемый способ получения новых пептидов заключается в том, что .пептиды общей формулы 2 34 5 6178 К-СН-СО-ГЛи-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис-Х 10 П 12 13 14 15 16 17 18 Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Аон-ЛИЗ 20 21 22 23 24 25 2627 ; Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре - Ала-ИлеТли-Вал30 31 32 Гли-Ала-Про-ЫН2 получают конденсацией фрагментов 1 - 10 и 11-32 с последующим удалением защитных rpynin и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитивных солей или комплексов известными приемами. При этом R-Н, NH2 или ацил-ЫП, X-остаток L-метионина, L-валина, L-норвалина, Lлейцина, L-изолейнина, L-норлейцинаили L a аминомасляной кислоты, а « положениях 11, 12,16, 17, 19, 20, 22 и 24 по меньщей мере одна из аминокислот замещена другой, а имбнйо Ь-треонил -Ь-лизи«ом, L-тирозин L-лейцином, Ь-фенила-ланин -Ь-лейЦнном, Lаспарагиновая (Кислота -L-гистидином, L-фенилаланин -лейцином, Ь-гистидин °-Ь - глютамином, Ь-фенилаланин -Ь-тирозином и L-глют а м и L- а р гини ном. Пример 1. Z - Тре(ТБу) - Тир(ТБу) Про-ОП. Н-Тир (тБу)-Про-ОП, полученный из 11,75 г 2-Тир(тБу)-Про-ОН, растворяют в 39 мл диметилформамида, ерозрачиый раствор охлаждают в ледяной ванне, лосле чего добавляют 2,81 мл N-метилморфолина и 12,2 г твердого 2-Тре(тБУ)-ОСУ. Полученный раствор я& 23 час оставляют при комнатной температуре упаривают, получанное желтокоричневое масло растворяют в этилацетате, и- трижды промывают разбавленным раствором лимонной кислоты, затем водой до нейтральной реакции. После высущивания сульфатом натрия этилацетатную фазу упаривают. Образуется белая пена, которую подвергают противоточному распределению. Т. пл. 90-94°С alg - 23° (с 1 метаноле) Пример 2. г-Тре-(тБу)-Про-Глн-Тре (Тбу) -Ала-Иле-Гли-Оме. 4,94 г 2-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Про-ОН растворяют в 40 мл диметилформамида, затем добавляют 3,95 г Н-Глн-Тре(тБу)-Ала-Иле-ГлиОМе и 1,07 г М-гидрочссисукцинимида, полученный раствор охлаждают в ледяной :ванне до 0°С, после чего добавляют 2,07 г твердого дициклогексилкарбодиимида. Раствор на 15 час оставляют при комнатной температуре, отфильтровывают от выделившейся дициклогексилмочевины, в фильтрат добавляют воду, отфильтровывают осевший осадок. Его промывают простым эфиром и переосаждают из этилацетата.-петролейного э.фира. Образуется порошок с т. пл 187-188°С.

Пример 3. Н-Асн-Лиз(БОК)-Фен-Гис-Тре (тБу) - Тир(тБу)-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-ИлеГли-ОН.

1,34 г 7-Асн-Лиз(БОК) - Фен - Гис -NHNHa растворяют В 6,2 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -20°С, затем добавляют 1,40 мл 3,0-н. НС1 в диоксане и 0,252 мл третбутилнитрита. Раствор на 15 мин оставляют при -15°, затем добавляют 0,724 мл iN-этилдиизопропиламИиа, охлаждают до -20С и добавляют раствор В 24 ил диметилформамида 1,12 г Н-Тре(тБу)-Ъир(тБу) - Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Иле-Гли-ОН, толучениого из заш,Иш,1ен1ного октапептида (см. пример 2). Раствор оставляют на 16 час при +5°С, потом ynaipnвают и добавляют Простой эфир. Образовавшийся осадок дважды обрабатывают простым эфиром. Полученный порошок отфильтро)вывают, промывают водой до удаления хлорида, растворяют в 70%-iHOM адетонитриле и добавлением абсолютного ацетонитрила снова осаждают. Для дальнейшей очистки его подвергают протнвоточному распределению. 930 г полученного продукта растворяют в ПО .мл 80%-ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 100 мг Pd/C. Затем фильтруют, фильтрат упаривают, добавляют ледяную уксусную кислоту И лиофильно высушивают.

П р и м е р 4. Z-Tpe - (тБу) - Тир (тБу) - Тре (тБу) - Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(БОК) Фен - Гис - Тре(тБу) -Тир(тБу)-Про-Гл«-Тре (тБу)-Ала,-Иле-Гли-ОН.

770 мг 2-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу)-ГлнАсп(ОтБу), Фен-МНЫП2 растворяют е 3,2 мл диметилформамида, слепла -мутный раствор охлаждают до -20°С и добавляют 588 мкл 3,0 - н. НС1 в диоксане н 98 мкл грег-бутилнитрита. Раствор оставляют на 15 мин при - 15°С, затем добавляют раствор 778 мг описаиного в примере 3 продукта в 14 мл диметилформаолида и 0,303 мл N-этилдииЗопроииламина, размешивают полученный раствор 5,5 час юрИ охлаждении льдом. В течение этого вреМени добавляют 0,076 мл N-этилдиизопропиламина. Раствор Hai 15 час оставляют при -+-5°С, затем медленно выливают в простой эфир, полученный белый осадок растворяют в диметилформамиде и снова выливают в охлажденную до 0°С 0,02-н-ооляную кислоту (в которую на 100 мл объема добавляют 10 мл насыщенного раствора поваренной соли). .Полученный при этом продукт растворяют в 80%-ном ацетонитриле, затем осаждают водой при 50°С. В .целях дальнейшей очистки продукт переосаждают из диметилформамида простым эфиром, а также из ацетонитрила водой.

Пример 5. Н - Тре (тБу) -Тир (тБу)-Тре (тБу) - Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Аон - Лиз (БОК)Фен-Гис - Тре(тБу) - Тир(тБу) - Про-Глн-Тре (тБу)-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЫН2

755 мг описанного в примере 4 продукта растворяют в 8 лл диметилформамида, в раствор при комнатной тем пературе добавляют 139 мг П-Baл-Гли-Aлa-lПpo-NП2, 47 мг Nгидроксисукцинимида и -84 мг дишгклогекоилкарбодиимида, перемешивают 18 час при 45°С. Затем раствор медленно выливают в иростой эфир, осажденный белый порошок

подвергают противоточному распределению.

233 мг полученного продукта растворяют в 80%-ной уксусной кислоте и гидрируют в присутствии 40 мг Pd/C В течение 18 час при комнатной температуре. Затем фильтруют,

упаривают почти досуха, растворяют в ледяной уксусной кислоте п лиофально высушивают.

Прим е р 6.

I

БОК-Цис-Гл1И-Асн-Лей-Сер(тБу)-Тре(тБу) IЦис - Мет - Лей - Гли - Тре (тБу) - Тир

(тБу) - Тре(тБу) - Глн - Acп(OтБy)-Фeн-AcнЛиз(БOK) - Фен-Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу)-ПроГлН - Тре(тБу) - Ала-Иле - Гли-Бал-Гли-Алаnpo-NH2.

171 мг описанного в примере 5 докозапаптидамида и 83,5 мг защищенного декапептида

БОК - Цис-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу)-Тре(тБу)I

Цис-Мет-Лей-|Гли-ОН растворяют в 1,16 мл диметилформамида при нагревании, после чего при комнатной температуре добавляют 15,9 мг твердого N-тидроксисукцинимида и 21,4 мг дициклогексилкарбодиимида, затем 3,5 час перемешивают при 45°С. Потом раствор по каплям добавляют в 23 мл свободного от перекиси простого эфира, ai полученный в виде осадка белый порошок подвергают для очистки противоточному распределению.

Пример 7.

I--1

Н - Цис - Гли - Аон - Лей - Сер - Тре-Цис Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре - Глн - Асп - ФенАсн - Лиз - Фен-Гис-Тре-Тир-|Про-Глн-Тре-АлаИле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЫН2, Тир -кальц-итонин М.

50 мг БОК-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу)-Тре

1

(тБу) -Цис - Мет-Лей-Гли-Тре (тБу) -Тир (тБу) Трет(тБу) - Глн - Аоп-(ОтБу) - Фен-Асн-Лиз (БОК) - Фен - Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу)-ПроГлн - Тре(тБу) - Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Алаnpo-NH2 расиворяют при 0°C в 1,2 мл концентрированной соляной кислоты, помещают в атмосферу азота и wa Ю мин оставляют при 0°С.

Затем замораживают сухим льдом и п-ри медленном повышении температуры до 0°С раствор концентрируют в глубоком вакууме. После добавления 2 мл воды лиофильно высушивают, остаток растворяют в 1 мл воды и, чтобы превратить в ацетат, медленно фильтруют через уравновешенную 0,02-н уксусной кислотой колонку (диаметр 7,5 мм; Н100 лш) слабо основного ионообменника (Мер-к No 11). Затем промывают 0,02-н уксусной кислотой до отрицательной реакции на реактив Фолпна, концентрируют элюат ц,о 2 мл н лиофильно высушивают. Полученный таким образом ацетат Тир - «альцитонина М представляет собой аморфный, белый порошок.

Аналогично получают Лей121 -кальцитонин М, - Арг - кальцитонин М, Гис Лей -ГлН - кальцитонин М, Вал -Тир2 -кальцитонин М, Вал -Лей , -кальцитонин М, Дезамино-Лей 21 -кальцитонин М, Дезамино-Тир - кальцитонин М, Дезамино - Вал Лей12,18,19 . кальцитонин М, Лей. is, iS-TpH a кальцитонин М, Вал -Лей, i, i9 . Тир - кальцитонин М, Дезамино - , i, «э-Тир кальцитонин М, Лей - кальцитонин М, Лей кальцитонИН М, Лей -кальцитонин М.

Предмет изобретения

СпосОб Получения новых пептидов формулы CH,-S,

II2 345 6

7 3

R - СН-СО-Гли-Асн-Лей-Сер-Три-Цис-Х-лей10П 1213 14 15 16 17 18 19

Гли - Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фе«-Асн-Лиз-Фен20 21 22 23 24 252627 28 29

Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала - Иле-Гли,-Вал3031 32

Глй-Ала-Про-МНггдеК-H,NH2 или ацил-NH, X-остаток L-метионина, L-валина, Ь-норвалина, L-лейцина, L-изолейцина, L-норлейЦина или Ь-а-эминомасляной кислоты « где по меньшей мере оцна из аминокислот заме1Ш,ена в положениях 11, il2, 16, 17, 19, 20, 22 ц 24 другой аминокислотой, а именно Ь-треонин L-лизином, Ь-тирозин2-Ь-лейцииом, L-фенилаланин -Ь-лейцином, Ь-аспарагиноваЯ кислота -Ь-гистидином, Ь-фенилаланин -Ь-лейцином, Ь-гистидин О-Ь-глютамином, L-фенилаланин 2-Ь-тирозином и Ь-глютамин24 - L - аргиHiiHOM, отличающийся тем, что указанные пептиды получают конденсацией известным методом, например карбодиимидным, фрагментов 1 -10 и 11-32с последуюш,им удалением заи итных групп и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитивных солей или комплексов известными приемами.