Способ получения пептидамидов или их солей Советский патент 1977 года по МПК A61K38/16 C07K14/585 

аин i- лейцином, i-фенилаланин в -лейцином, Z-фенилаланин 1-лейци ном, 2-фенилаланин Z-тирозином и t -глютамин 1-аспарагином или их солей, заключающийся в том, что соединения общей форму,пы еН28Н . 14 3 4„ f S 7 R-сн-со-Гяи- Асм-лвб-сер-трв-цисiЭ to «f 12 t3 14 IS Р «т-лей-Гяи-Трв-тир-тре-гля Асп f« 17 19 19 20 21 22 Д -Фад -ACH - Au3- «Рел- rufi-Тйе- в «я-про 24 Its 2б 27 al Zf SO |1 -ГЯН - Tpe- Ала - we- mu- воя-гли-Ало J2.., -Яро - NHa (у) где ft. имеет 1 указанные значения 1 - аланйн- заменен 2-аспарагин и/или 2-изолейцин заменен IL-Tpeo нином и где, в соответствующем случа одна амин экислота или несколько амин кислот заменены в положениях 3,11,14 16,19,22 и 24 указанными аминокислот ми, причем меркаптогруппы остатков 1 и 7 свободны или защищены тритильной клц ациламидометильной группами, окисляют йодом в растворителе при комнатной температуре с образованием дисульфидной связи. Целевой гзродукт выделяют известными приемами, В качестве растворителя предпочтительны метанол или уксусная кислота. В 1 5честве кислотно-аддитивных солей- используют соли терапевтически применяемых кислот, например соляной уксусной, серной, фосфор.ной исульфо новой кислот, или низших алкансульфо новых, бёнзолсульфонозой; или толуолсульфоновой кислоты. в тонокослойной хроматографии (ТСХ применяют следунадие системы: 43С :-греГ-амиловы спирт« йзопропанол-вода (51{21:28) 45 вгор-бутанол-3%-ный водный акмиак (70:30) 52 I W-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (75:7,5:21) 52А : «-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (67:10:23) 70 I этилацетат-пиридин-вода (40: 20:40) верхняя фаза 89 : этилацетат-ацетон-вода (72:24i4) 96 : Лг р-бутанол-ледяная уксусная Гсислота--вода (67- 10:23) 100 : этнлацетат-пиридин-ледяная п сусная киелота-вода (62:21:6:1) 101А : -бутанол-пиридин-ледяиая уксусная кне/йэта-вода (42:24:4:30) 1б2А ледяная уксусная кислота-ме в-илэтнлкетои-муравьиная кислота-вода (50 30t10 10) 107 : этилацетат-пиридин-вода (49:24: 7) 112Е : н -бутанол-пиридин-муравьиная Кислота-вода (44:24:2:20) 121 : изопропанол-25%-ньгй водный йммиай-вода (70:10:20) 121А : изопропанол-25%-ный водный аммиак-вода (85:5:10) Rf - значения для ТСХ:ТС -на готобых пластичных из силикагеля SL 254 фирмы -ntec, biis e ede-п; гЦ - на готовых пластинах из Целлюлойы фирмы Mftrck Oo-fmstadfe tA - на алокс-пластинах (45 г фирмы Camag-, Mutteuz.+ з,5 г ипса, толщина в 0,3 мм). В примерах применяют следующие сокращения : Бок - т/ вг-бутилоксикарбонил f - карбобензокси ОтБу - сло(ный Tyoef-бутиловый эфир Онп - слоусный (7-нитрофениловый эфир - сложный метиловый эфир - сложный оксисукцинимидовый тБу - простой трег -бутиловый эфир Бмп - 1 -меркаптопропионил. Пример. Получение Н-Цис-Гли-Асн-Лей Сер-Тре-Цис-Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Дсн-Лиз-Фен-Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЫЙ2 (Тре -кальцитонин М). ( 80 мг (тpи)-Гли-Acн-Лeй-Cep- -Tpe-Циc- (три)-Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Асн-Лиз-Фен-Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- МНг -трифторацетата растворяют в 40 мл 95%-ной уксусной кислоты и по каплям при сильном перемыиивании за 1 ч прибавляют к смеси 100 мг йода в 120 МП 95%-ной уксусной кислоты. Затем перемешивают еще 2 ч при комнатной температуре, добавляют 200 мл воды, экстрагируют избыточный йод взбалтыванием небольших порций смеси со 100 мл тетрахлорметана до обесцвечивания экстрагируемой смеси. Водный раствор высушивают лиофилизацией, остаток растворяют в 5%-ной уксусной кислоте и фильтруют через колонку с ионообменника №11 фирмы МегсК(слабоосмовнор, ацетатная форма). Элюат высушивают лиофилиэацией и получают Тре т-кальцитонин-.М-ацетат, 80 мг которого растворяют в 5 мл воды и при перемешивании прибавляют к раствору 1,2 мл слабоосновного ионообменника в виде свободного основания, рН раствора 6,5, ацетат выпадает в виде мел-: кого осадка. Смесь перемешивают 2 ч, при этом рН раствора повьвиаётся до 7,1. Осадок и ионообменник отфильтровывают, промывают водой и осажденный пептид растворяют в теплой 90%-ной уксусной кислоте. Смолу отфильтровывают, промывают 90%-ной уксусной кислотой, уксуснокислый раствор высу шивают лиофилизацией и получают 74 м Трё -кальцитонина М в виде укс/снокислой соли высокой степени чистоты по показаниям ТСХ и электрофореза. ТА «К(52) 0,49 кальцитонин М : Rf (52) 0,55. ТЦ :Rj.(I01A) « 0,52 кальцитонин м RfXlOlA) «0,57. tipH тонкослойном электрофорезе (плА тины из целлюлозы, рН 1,9, 2 ч, 280 пройденное расстояние 4,5 см от като да {кальцитонин М : пройденное рассто яние 4,5 см). При анализе аминокисло ты после ПОЛНОГО гидролиза (б н. HCS , 24 ч) продукт содержит вычисленное количество аминокислоты. Исходный материал получают следую образом. A.Х-Ала-Тре(тБу)-Гли-Оме. Смесь 18,9 г 1-Ала-Онп, 13,4 г Н-Тре-(тБу)-Гли-Оме-хлоргидрата, 100 диметилформамида и 6,2мл -метилморфолина перемешивают 17 ч при комнатной температуре, растворитель отгоняют при пониженном давлении, остаток растворяют в сложном уксусном эфире, промывают и сушат. Раствор упаривают досуха, остаток кристаллизуют из смеси эфир - петролейный зфир и получают 16 г продукта, г.пл.-104-106°С. Б. Н-Ала-Тре-(тБу)-Гли-Оме. 13,3 полученного в п. А продукта гидрируют в метаноле в присутствии 1,5 г палладиевого угля (10% палладия) и получают 9,4 г бесцветной смолы. B.1 -Тре-{тБу)-Ала-Тре-(тБу)-Гли-Ом 9,4 г полученного в п. Б продукта и 13,2 г 1Ь-Тре-(тБу)-Осу растворяют в 100 мл .диметилформамида и выдерживают 17ч при комнатной температуре Реакционную массу вливают в 500 мл ледяной воды. Выпавший осадок отфильтровывают, высушивают и кристаллизуют из смеси ацетон - петролейный эфир, в которую добавляют в. небольшом количестве воду и получают 13,6 г продукта, т.пл. 193-195 С. Г. Н-Тре тБу)-Ала-Тре (тГ;у)-Гли-Оме 13,1 г полученного в п. В продукта гидрируют в 750 мл метанола в присутствии 2,6 г палладиевого угля. Получают 9,95 г бесцветного масла. Д. г-Глн-Тре-(тБу)-Ала-Тре-(тПу)-Гл Оме получают как производные тетрапеп тида аналогично п. Б. Продукт кристал лизуют из метанола, выход 10,7 г, т.пл. 198-202с. Е. Н-Глн-Тре-(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Оме. 10 г полученного в п. Д продукта гидрируют в 1 л метанола в присутст. ВИИ 2 г палладиевого угля. Получают 8,2 г продукта. Ж. 2-Тре-(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу| -Ала-Тре-{тБу)-Гли-Оме.. К. 8,2 г полученного в п. Е продук та прибавляют 8,3 г Е-Тре(тБу)-Фвн-Про-Он, затем 100 мл диметилформамй да, 4,0 г N-оксисукцинимида и 4,2 г дициклогексилкарбодиимида, смесь перемешивают 17 ч при комнатной температуре , выпавшиую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат вливают в 1,3 л ледяной воды, 2 ч осадок отфильтровывают, cyniair и смешивают с 120 сложного уксус но го эфира. Иерастворимвыи{ ся порошок отфильтровывают, промывают сложным уксусным эфиром, сушат и получаю 8,5 г продукта ТС :Rf(l2lA) 0,78; Rf (102А) 0,85; Rj.(43C) 0,71. 3. 2.) -Фен-Про-Глн-Тре {тБу)т -Ала-Тре-(тБу)-Гли-ОН. 5,15 г полученного в п. Ж продукта растворяют при нагревании в 110 мл 90%-ного метанола, охлаждают до и прибавляют 13,5 мл 1,0 н. водного раствора едкого натра. Через 10 мин. к смеси добавляют 45 мл воды, а через 5 мин еще 25 мл воды. Через 20 мин раствор выливают в 270 мл ледяной 0,05 н. водной соляной кисло ты, осадок, отфильтровывают, промываю ледяной водой и смесью вода - ацетонитрил {4 1) , высушивают и получают 4,1 г продукта. ТС Rj(45) 0,27; Rj(lOO) 0,33; llf(43C) 0,28. И. II-Tpe- (тБу) -Фен-Про-Гли-Тре (тБу)-Дла-Тре(тБу)-Гли-ОИ. 3,65 г полученного в тз. 3 продукта суспендируют в 125 мл диметилформамяца и гидрируют в присутствии 0,5 г палладиевого угля (10% палладия). Продук (2,62 г) растирают с водой, фильтруют и высушивают. и тс :Rf,(100),12 R|(52) 0,23. К, Z -Лен-Лиз (тБу) -Фен-Гис-Тре- (тБу);-Фен-Про-Глн-Тре(тВу)-Ала-Тре-(тРу)-Гли-ОН. 7,2 г Z-Ане-Лиз-(Бок)-Фен-Гис-ЛНКН« растворяют при нагревании до в 30 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -З&С и прибавляют к нему 7,74 мл 3,7 н. хлористого водорода в диоксане, затем 1,42 мл трвг-бутилнитрата. Смесь вьЗдерживай 10 мин при , вновь сжимают температуру до -30°С и прибавляют по каплям раствор 6,45 г Н-Тре- {тБу)-Фен-Про-Гли-Тре-(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-ОП и 7,8 мл N-этилдиизопропиламина в 70 мл диметилформамида. Раствор выдерживают 18 ч при и затем вливают в 400 мл ледяноп 1%-ной уксусной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и высушивают в вакуу-. над хлоридом кальция.- Продукт дегидрируют с ацетонитрилом, фильтруют на нутче и высушивают. ТС :Rj (70),33; tlf (100) «0,21.

Л. г. -Лен-Лиз (Пок) -Фен-Гнс-Тре(тВу)-Фен-Про-Глн-Тре-(тРу)-Лла-Тре (тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-Н Н.

К смеси 7,5 г -Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре-(тБУ)-Фен-Про-Глн-Тре-(тБУ)-Ала-Тре(тБУ)-Гли-ОН, 0,99 г Л -оксисукцинимида, 1,84 г Н-Вал-Гли-Ала-Про-yVH вг 70 мл диметилформамида прибавляют 1,11 г дициклогексилкарбодиимида и перемешивают 5 ч при 45 С. Реакционную массу вливают в 1,2 л охлажденного до 0°С эфира, выпавший осадок отфильтровывают и сушат. Продукт-сьрец смешивают дважды (каждый раз) с 200 мл смеси ацетонитрил-метанол (9:1), фильтруют, вь-сушивают и Получают 8,5 г продукта.

ТС : Tlf (45) .- 0,50; Rr (96) О, 46; R. (1 00 ) О , 29 ; R. (1/1) -0,80.

М. F-Лен-Лиз (Бок) -Фен-Гис-Тре (тБу) - Т ен-Про-Глн-Тре (тБу) -Ала-Тре (тПу) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про- N H -aueTaT.

7,05 г полученного в п. А продукта гидрйрую± в 400 мл 80%-йой уксусной кислоты в присутствии 1 г палладиевого угля (10% палладия) и получадот

6.6г продукта.

ТС : R (96) 0,35; R. j. (121),72 R-f (45) 0,27.

П. г -Тре-(тБу)-Тир-(тБу)-Тре(тБу)Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре (тБУ)|-Фен-Про-Гли-Тре- (тБу) -Ала-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-npo-NH

565 мг Х-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Тре-(тБу-Глн-Асп (СтБу) -Феп- Ы Н N Hj, растворяют при нагревании до в 4 мл дйметилформамида, затем раствор охлаждают до -2Q°C, прибавляют к нему 0,35 мл

3.7н. хлористого водорода в диоксане и 0,067 мл трег -бутилнитрита. Смесь перемешивают 10 мин при и к полученной массе прибавляют по каплям охлажденныЛ до 0°С раствор 600 мл Н-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тРу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЫН -ацетата в 5 мл диметилформамида и 0,33 мл М-этилдиизпропиламина, перемешивают 5 мин при -15°с, нагревают до 22°С и продолжают перемешивать еще 6 ч. Затем реакционн смесь вливают в 100 мл ледяной воды, выпавший осадок отфильтровывают,промывают водой и высушивают при пониженно давлении над хлоридом кальция. Смесь переосаждают из смеси метанол-вода, осадок ,- сушат растирают с ацетоном и получают 650) мг продукта.

: 1lj(43C) 0,33, Я. (70)-0,60.

О. П-Тре(тБу)-Тир(тБу)-Тре(тБу)-Глн-Асп(ртБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-ТреГтБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- NHj.

610 мг полученного в п. Н продукта гидрируют в 25 мл 80%-но; уксусной кислоты в присутствии палладиевого угла. Продукт растворяют в 50 мл водо- насыщенного у-бутанола. Для удаления.

уксусноЛ кислоты растнор промывают . дважды разбавлениьлм содовым раствором, дважды полунасыщенным раствором хлорида натрия и водоП. Бутанольной слоп отделяют, упаривают при пониженном давлении и получают 605 мг продукта Б виде бесцветной пены. ТС : Я (100) 0,20; R.J (96) 0,40 П. Пок-Цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер (тЕу)-Тре-(тБу)-Цис (три)-Мет-Лей-ГлиТре(тБу)-Тре(тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-ФенАсн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБу)-ФенПро-Глн-Тре (тБу)-Ала-Тре(тБу)-ГлиВал-Гли-Ала-Про- .

К смеси 605 мг И-Тре (тБу)-Тир (тБу)-Тре (тБу)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис-Тре-(тБу)-Фен-Про-Глн:-Тре(тБу)-Ала-Тре(тПу)-Гли-Вал-ГлиАла-Про N11- , 330 мг декапептида Бок-Цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер(тБу)(тБу) -Цис (три) -Мет-Лей-Гли-ОН,

46 мг 1-оксибензтриазола и 10 мл диметилформамида прибавляют 75 мг дициклогексилкарбодиимида,. перемешивают 90 мин при 40С и затем 18 ч при 23С, выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают, маточник вливают в 100 мл ледяного эфира, свободного от перекисей. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и высушивают. Полученный продукт-сыре растворяют в смеси диметилформамидметанол (1:1), раствор фильтруют через колонку (высота 100 см, диаметр 4 см) на Сефадекс (алкилированныЛ сшитый полидекстран), которая приготолена в топ же смеси. Собирают фракции по 5 мл, высушивают досуха, вначале при 11 мм рт.ст., а затем-при 0,01 мм рт.ст. и 45С температуры ванны. Чистоту полученный фракций контролиру ют тех на силикагеле. Получают Бок-Цис-(три)Гли-Асн-Лей-Сер(тБУ)Тре(тБУ)-Цис(три)-Мет-Лей-Гли-Тре(тБУ-Тир(тБУ)-Тре(тБУ)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок)-Фен-Гис-Тре(тБУ)-Фен-Про-Глн-Тре(тБУ)-Ала-Тре(ТБУ)-Гли-Baл-Гли-Aлa-ПJЭo- Н с Р (100) 0,54 Р (70) 0,65. 135 мг полученного продукта растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты, раствор оставляют на 1,5 1,5ч при комнатной температуре,добавляют к нему 30 мг трифенилкарбинола и оставляют еще на 10 мин.Затем упаривают досуха на роторном испарителе при температуре бани 30 С,остаток растворяют в свободном от перекисей эфира. Полученный порошок отфильтровьшают, промывают эфиром и сушат при пониженном давлении нгщ едким натрием. Получают 87 мг Н-Цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис(три)-Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Асн-Лиэ-Фен-Гис-Тре-Фен-Про-ГлнТре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- Н трифторацетат, который может быть