Способ получения полипептида Советский патент 1980 года по МПК C07K14/585 A61K38/23 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА

Изобретение относится к способу получения нового полипептида-аналога кальцитонина, биологически активного соединения, которое может найти применение в медицине. В пептидной хими широко известны способы образования пептидной связи, например карбодиимидный l , также широко используют для отщепления защитных групп фтористый водород 2J. Цель изобретения - получение новых соединений, обладающих ценными фармакологическими свойствами. Поставленная цель достигается опи сываемым способом получения полипептида формулы (1) , -tCHo), ;0-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр- HN С Н С 0-Мет- Лей -Гли-Тр-Тир-Тр-Глн-Асп-Фе-Асн-Лиз-Фе -Гис-Тр-Фе-Про-Глн-Тр-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-М Н 2. Способ заключается в том, что соеди нение формулы С1 I) I: (CHj);,; Ч;0-Гли-Асн-Лей-Сер-/Взе ЬТр-/Взе ;- Н N с Н -Мет-Лей-Гли-ОН денсируют с соединением форму(III) р- Взе -Тир- ВзС-(Cl2)-Tp-Bзe-Глнп-OBзC-Фe-Acн-Лиз-CECбз-Фe-Гиc-Bз6 -Фе-Про-Глн-Тр-Вз г -Ала-Илеи-Baл-Гли-Aлa-Пpo-NHгоследующим отщеплением защитных пп от полученного лродук та кондении. В указанных формулах приняты слещие сокращения: Вос-трет-бутоксикарбонил Сбз-бензилоксикарбонил Вз -бензил ВзЕ (Сба. )-дихлорбензил OEt-этиловый сложный эфир ОВзй-бензиловый сложный зфир Cep-L-серин Лей-1-лейцин Вал-1-валин Apr-L-аргинин Ала-L-аланин Лиз-1-лизин Глю-1-глютаминовая кислота Тир-1-тирозин Фе-L-фенилаланин ТФК-трифторуксусная кислота ЦГА-циклогексиламин ТГФ-тетрагидрофуран AcOEt-этилацетат WSC-К-этил-Ы-диметиламинопропилкарбодиимидrCH-N-OKCHcyKUHHMMHfl МеОН-метанол АсОН-уксусная кислота ГМФА-гексаметилфосфортриамид АОС-трет-амилоксикарбонил СССбэ-о-хлорбензилоксикарбонил Тоз-тозил Ови-трет-бутиловый сложный эфир ONP-п-нитрофениловый сложный эфир OSU-N-оксисукцинилимидный сложный AcH-L-аспарагин Tp-L-треонин Про-1-пролин Acn-L-аспарагиновая кислота Гли-глицин Глн-1-глютамин Гис-1-гистидин Мет-1-метионин Иле-1-изолейцин ТозОН-п-толуолсульфокислота ДЦГА-дициклогексиламин ДМФ-диметилформамид ДЦК-дициклогексилкарбодйимид ОБТ-1-оксибензотриазол EtOH-этанол БуОН-бутанол Аминокислотный анализ. Образец гидролизуют 6 в. соляной кислотой (с добавлениеп нескольких капель анизола) при 110°С в течение 45 ч и сушат при пониженном давлени а затем подвергают аминокислотному анализу. Пример. Получение (С.2 )5 :0-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр-ННСНСО-Мет-Ле -Гли-Тр-Тир-Тр-Глн-Асп-Фе-Асн-Лиз-Ф Гис-Тр-Фе-Про-Глн-Тр-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНг2,О г (0,6 моль) ВОС-Тр-ВзЕ-Тир-тЬзе/(,С&а ) -Тр-ВзЕ-Глн-Асп-ВзЕ -Фе-Асн -Лиз-СЕСбз-Фе-Гис-Тр-ВзЕ.-Фе-Про-Глн -Тр Вз -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про -NH2. растворяют в 10 мл ТГФ при -5° Раствор перемешивают в течение 30 м при комнатной температуре и концент рируют в вакууме, продукт осаждают этилацетатом. Осадок отделяют, суша над гидроокисью натрия. Сухой осадо растворяют в 10 мл ДМФ и устанавливают рН 9 путем добавления триэтила на при охлаждении. К раствору приба ляют воду до образования осадка. Ос док отделяют, сушат над для по лучения вое соединения в виде свобо ного основания. 0,8 г(О,71 моль) Ю-Гли-Асн-Лей-Сер-ВзЕ-Тр-Взб-HNCHC -Мет-Лей-Гли-ОН растворяют в 5 мл смеси ДМФ и N-метилпирролидона (1:1 К раствору прибавляют 122 мг 0511, а затем при охлаждении 146 мг ДЦК, растворенного в 3 мл ДМФ, и перемешивают в течение ночи. Выпавший осадок удаляют и к маточнику прибавляют ВОС-свободное основание, полученное выше, и прибавляют 100 мг ОБТ, потом смесь перемешивают 5 дней при 30 С. К реакционной смеси прибавляют воду. Отфильтровывают образовавшийся при этом осадок, промывают водой, затем сушат, получают 2,6 г CO-Гли-Асн-Лей-Сер-ВзВ-Тр-Взб-HNCHCO-Мет-Лей-Гли-Тр-ВзК-Тир-ВзЕ (СК)-Тр-Взе-Глн-Асн-ОВзе-Фе-Асн-Лиз-Cg Сбз-Фе-Гис-Тр-Взб-Фе-Про-Глн-ТрВзЕ-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНгв качестве сырого продукта. 1,0 г этого продукта обрабатывают 25 мл фтористого водорода, 0,1 г метионина и 2 мл анизола при -5°С в течение 60 мин при охлаждении смесью сухого льда и метанола при пониженном давлении в присутствии диметилтиоэфира. После отгонки фтористого водорода остаток промывают диэтиловым эфиром и собирают декантацией. Процедуру повторяют три раза, и осадок растворяют в смешанном растворе 30 мл уксусной кислоты и 10 мл воды. Затем раствор пропускают через колонку с Дауэкс (12) ацетатная форма (2, см), промывают 200 мл воды и снова пропускают элюат через колонку НР-20 (2,5x7 см). 80%-ный этанольный раствор пропускают через колонку и после удаления из элюата этанола раствор лиофилизируют, получают 440 мг порошка. Раствор 440 мг порошка в 0,01 М водном ацетате аммония вносят в колонку, наполненную СМ-целлюлозой (2, см) и продукт элюируют с линейным градиентом элюирования 0,01-0,2 1 М ацетатом аммония (каждый - 750 мл), рН-4,5. Собирают фракции по 10 мл и активные фракции (фракции №№ 67-70) объединяют и сушат вымораживанием для получения активного порошка. Лиофилизат растворяют в 1 М уксусной кислотеи хроматографируют на колонке с Сефадексом (2, м), элюируя продукт 1 М АсОН. Собирают фракции по 6 мл, активные фракции (№№ 28-37) лиофилизируют. Лиофилиэат растворяют в верхнем слое смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5) и загружают раствор в колонку с Сефадексом G-25 (2,7 f Х52 см), который был упакован вместе. с нижним слоем указанной выше смеси растворителей и после этого помещен в верхний слой указанной смеси растворителей. Элюирование проводят тем же верхним слоем, активные фракции (трубки 5-14) собирают и лиофилизируют. Полученный порошок повторно хроматографируют в тех же условиях на Сефадексе G-25 и лиофйлизируют. Лиофилизированный активный порошок растворяют в 1 М уксусной кислоте, выливают в колонку с Сефадексом LH-20 (2, см), элюируют 1 М уксусной кислотой, собирают фракции по 5 г. Активные фракции объединяют и лиофйлизируют для получения 29,7 мг продукта 1000 MRC (мг) . Rr О,82/носитёль Мерк целлюлоза, проявитель:н-бутанолуксусная кислота-вода-пиридин (15: 3:12:10). RI; О, 43/носитель Мерк целлюлоза, проявитель:н-бутанол-уксусная кислота-вода (верхний слой)4:1:5/. (d)j)- -69,6(,72, 1 М уксусная кислота). Аминокислотный анализ: Лиз 1,15(1) Гис 1,01(1), Асп 2,94(3),Тр 4,80(5), Сер 1,06(1), Глю 2,14(2),Про 1,96(2), Гли 4,00(4), Ала 2,00(2),Вал 0,95(1), Мет 0,87(1), Иле 0,96(1),Лей 1,84(2), Тир 0,96(1),Фе 3,18(3), .L-аминопробковая кислота 1,02(1). Формула изобретения Способ получения полипептида формулы (I) (снг),., :О-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр- HN с Н С 0-Meт-rЛeй-Гли-Tp-Tиp-Tp-Глн-Acп-Фe-Acн-Лиз-Фe-Гиc-Tp-Фe-Пpo-Глн-Tp-Aлa-Илe-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНа, отличающийся тем, что соединение формулы (II) (CH,j)5-Гли-Асн-Лей-Сер-Взб-Тр-ВзЕ-HN С Н С О-Мет-Лей-Глй-ОНконденсируют с соединением формулы (III) Н-Тр-Вз6-Тир- взЕ(CKj)J-Тр-ВзЕ-Глн-Дсп-ОВзЕ-Фе-Асн-Лиз-сеСбз-Фе-Гис-Тр-ВзЕ-Фе-Про-Глн-Тр-ВзЕ-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- N с последующим отщеплением защитных групп от полученного продукта конденсации. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Шредер Э., Любке К., Пептиды, ч, 1, М., Мир, 1967, с. 116. 2,Там же, стр. 112.