и ОТКйЫТИЙ Советский патент 1973 года по МПК C12N9/48 

Авторы изобретения Иоахим Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕАЗЫ Юкидлер, Вольфганг Шрейбер и Вильгельм Фишер (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма «Хенкель и СИ ГмбХ (Федеративная Республика Германии) Иностранцы

Изобретение касается :лОх;ооа иолу-юип/: иротеазы с высоко эизиматическон активностью н особенной стабильностью.

Известен снособ получения протеазы путем культивирования микроорганизМов, относящихся к виду Bacillus licheniformis, на питательной среде, содержаией источники углерода, азота и минеральные соли при значеним рИ среды предиочтительио 6,5-8,0 и темлературе предпочтительно 35-40 С с последующим выделением фермента из .пьнои л идкости.

По предлагаемому способу попользую щтамм Bacillus Ikheniformis Р-ЗОО для Иолучения протеазы с. высокой энзиматической активностью и иЛИроким спектром устойчивости, в ча-стности высокой стабильностью к хелатообразователям.

Иример 1. Для приготовления питательной среды диспергируют в 1 л воды 50 г растворимого крахмала, 20 г соевой муки, 10 г казеина, 5 г (NH.Os-HPO.i и 0,5 г сульфата магиия.

Иеред стерилизацией при помоищ разбавленного натрового щелока значение рИ среды устанавливают 7,5. После стерилизации получают значение рН почти 7,0. Питательную среду заражают бациллой Р-300 и при встряхивании культивируют ее в течение 42 час нри 37°С. По нстечении этого времени центрифуги

руют це-ггрпфугироваииый бульон применяют для оггределения активности протеазы. При этом усгаил ливают, что бульон обладает ферментатиилой активностью 13800 единиц иротеазы (РЕ) на каждый миллил тр.

При м е р 2. Опыт для выращивания бациллы Р-300 проводят в двадцатилитровом ферментере с 12 .2 питательной среды. Питательпая среда содержит 10% распавшегося иосредством бактер-амилаз картофельного крахмала, 2% соевой муки, 1,5% желатииы, 1% ХаоНРО.) в водоироводной воде. Скорость иере.мешиван 1я вмонтированной лопастной мешалки составляет 70 об/мин. Аэрация составляет 12 л/мин, т. е. соотнощение объема питательного раствора к иодве.денному объему воздуха составляет 1;1.

Во время ферментапии значение рП питат тельной среды дополнительно -регулируют ч

1 поддерживают при 7,0.

Во время выращивания, которое проводят п теченне 55 час, температура составляет 39°С. По истечении этого времени раствор центрифугируют и затем определяют активность протеа зы. При этo устанавливают, что полученный раствор обладает ферментативной активностью 18000 единиц протеазы (РЕ) на каждый МИЛЛИЛИТр.

Пример 3. Опыт для выращиваиия ба() циллы Р-300 проводят в пятнадцатилитровом ферментере с 10 /г питательной среды. Для приготовления питательной среды суопензируют 1000 г амилазы расщепленного картофельного крахмала, 250 г соевой муки, 100 г казеина, 50 г желатины, 100 г воды от набухшей кукурузы, 150 г Na2HPO4, 5 г сульфата магния в водопроводной воде -и дополняют до 10 л. Значение рН питательной среды устанавливают при помощи разбавленного натрового щелока до 7.2. После стерилизации значение рН раствора составляет 6,5. После засевания бациллой Р-300 в питательную почву культивируют в течение 50 час при 39°С. Для аэрации каждую минуту вводят 10 ,; воздуха и скорость перемешивания составляет 300 об/мин. По окончании культивировании центрифугируют, а в полученном растворе определяют энзиматкческую активность, которая составляет 19400 РЕ/мл. При дальнейшей переработке 5 л центрифугированного бульона из ферментера примешивают к 100 2 кристаллического хлорида кальция, устанавливают рН 7,5 и фильтруют. Фильтрат сгущают В вакзуме до получения 1,7 л. Медленной добавкой 425 г сухого сульфата натрия изсгущенного раствора осаждают энзим и выделяют фильтрацией. При этом из 5л центрифугированного бульона получают 98 ,протеазы в порошке. Энзиматическая активность полученной иротеазы в порошке составляет 750 РЕ/,ил. Для определения устойчивости путем культивирования бациллы Р-300 протеазы раствор, полученный согласно примеру 3, энзима подвергают инактивирующему воздействию различных хелатообразователей, ловерхностио-активных продуктов и пербората при различных температурах. При этом время воздействия изменяется от 15 до 60 мин. Для сравнения работают одинаковым образом при помощч обычных протеолитических энзимов. Затем определяют остаточные активности, которые меняются относительно начальной активности . В сравнительные испытания устойчивости включают следующие протеолити ческие энзимы:протеаза Р-300 по предлагаемому способу неразбавленный энзим (приближенно 600000 РЕ/г); протин А, нераз)бавленный энзим (приближенно 500 000 РЕ/г); алКалаза, разбавленный N33804 (приближенно до 100000 РЕ/г энзим); максатаза, разбавленный Na2SO4 (приближенно до 100000 РЕ/г энзим); сифа, разбавленный Na2SO4 (.приближенно до 100000 РЕ/г энзим). Устойчивость проверяли по сравнению со следующими продуктами: нитрилотриуксусная кислота, натриевая соль; этилендиаМИнтетрауксусная кислота, натриевая соль; перборат натрия; линейный алкилбензолсульфонат с фрикционным распределением по молекулярному весу алкила, %: С,о4,1; С„ 51; Ci2 34,3; Ci3 10,6; натриевая соль сульфата продукта присоединения 2,2 моль окиси этилена к 1 моль спирта жирного ряда с длиной цепи Ci9:Ci4 в соотношении 70:30; натровое мыле на основе насыщенных жирных кислот с фракционным распределением по молекулярному весу, %; Ci2-CIG 38; Ci8-С20 30; С22 32; продукт присоедииения 10 моль окиси этиле1 а к 1 моль смеси из олеилового и цетиловогп сиирта с йодным числом 45. Для ириготовления отдельных растворои применяют следующие вспо могательные реактивы. Синтетическая водопроводная вода, полученная для определения протеолитической активности в энзиматических концентратах. С этой целью в каледом случае растворяют 58,15 .г СаС1-2 Н20, 28 г jMgCl2-6 Н2О и 42 г NaHCOs в дистиллированной воде, а раствор наполняют до 2л 100 мл этого запасного раствора, перемешивая в пятилитровом патрубке, добавляют к 3 л дистиллированной воды, это количеств.) переводят в 10-литровый сосуд и наполняют дистиллированной водой до 10 л. Полученная таким образом синтетическая водопроводная вода 15° германской жесткости служит для ириготовления части растворов веществ, по сравнению с которыми проверяют стабильность энзимов. В качестве буферного раствора применяюч 0,005 М раствор трис-(гидрокси метил)-аминометана, который получают путем растворения 6,05 г этого вещества в 9 л дистиллированной воды, нагревания до желаемой позже инкубационной температуры, добавки соляной кислоты до получения желаемого значения рП, охлаждения и заполнения до 10 л. Для проведения испытания устойчивости сначала получают упомянутые в таблицах растворы 1 и 2, а именно раствор 1 путем растворения указанных количеств питательного вещества в 100 мл синтетической водопроводной или дистиллированной воды, нагревания до желаемой позже инкубационной температуры, добавки соляной кислоты или натрового щелока до достижения желаемого значения рН и охлаждения, а раствор 2 путем растворения указанных количеств энзима в 100 мл буферного раствора. Равные объемные части растворов 1 II 2 смешивают при комнатной температуре, непосредственно после смешивания отбирают проб} для определе)1ия активности

Раствор 1

навеска, мл

Устойчивость к действию линейного сульфоната алкилбензола при тем пературе иакубации 40°С, периоде инкубации 30 мин и рН 8

Устойчивость к действию алкилэфирсульфата при температуре инкубации 50°С, периоде

10 мг Р-300

дистиллированная вода 7 мг Протнна А 25 мг Алкалазы 25 мг Максатазы 50 мг Сифа

Таблица 3

при инкубационной температуре приведена ниже.

Таблица 4

11нкубацип 60 мин и значении рН 9 лри инкубационной те.мпературе показана в табл. 5.

Таблица 5

до воздействия испытательного вещества при повышенной температуре. Остаток разделяют на три части и инкубируют при указанной в таблицах темлературе.

После указанного времени инкубацни опять отбирают пробы для определения активности Et. Полученные средние значения из трех определений вносят в нижеследующие та-блицы. Продентное изменение активности вследствие влияния испытательных вещеста относительно начальной активности .

При определении активностей работают так, что в упомянутое выше время аликвотные части растворов «нкубируют с казеином, прекращают добавкой трихлоруксусной кислоты, фильтруют, а экстинкции фильтратов при 275 и 300 мм определяют при помощи полученных

холостых проб. Эти различия экстинкции в таблицах обозначены ЛЕо и Et и представляют собой меру активности исследуемых проб, которые содержат влияющие на стабильность химикаты, однако еще не были подвергнуты никакому воздействию тепла. Значения измеряют при одинаковых пробах после указанного воздействия teплa.

Соотношение является мерой для стабильности примененного энзима при заданных условиях. Из него вычисляют оставщуюся после воздействия тепла активность в процентах от начальной активности .

Устойчивость к действию натриевой солч нитрилотриуксусной кислоты при темоературе инкубации 55°С, в течение 60 мин и рН 8,0 при температуре инкубации приведена в табл. 1.

Таблица 1

Устойчивость к действию натриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты нри температуре инкубации 50°С, периоде инкубации

Раствор

15 мин и значении рП 8 при темлературе инкубации приведена в табл. 2.

т а б ,1 и ц а 2

Остаточные активности

навеска,

иавсска, мгЛОО мл г/100 мл

0.002дпстллЛНро и а и. пая вода

Д 100

/:-„

0,43

82

0.52

0,11

Ю 52 0.29 0,21 52 ОС. 0.55 Устойчивость к действию пербората натрия при температуре инкубации 50°С, периоде ий- 65 кубации 30 мин и значении рН 8 при инку( uHoiiiioii температуре приведена в табл. 3. 910

Устойчивость к действию натрового мы.икубацни 30 мин и значении рН 9 при инкубапри температуре 45°С, периоде ин-ционной температуре показана ниже. Устойчивость К действию .продукта прИСоединения окиси этилена Ж при температуре инкубации 60°С, периоде инкубации 60 мин и рН 8

399146

Таблица 6 при инкубационной температуре показана няже. Таблица 7