СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Советский патент 1972 года по МПК C12N9/24 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов, способных лизировать оболочку клеток Chlorella, дрожжей н т. п.

Известен способ получения литического фермента путем выращивания его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

Иредложенный снособ отличается от известного тем, что в качестве продуцента используют микроорганизм Micropolys рога 434. Ири этом выращивание последнего желательно производить при температуре 40-60° С в течение 16-24 час.

Микрооргапиз.м Micropolys рога 434 имеет следующую характеристику.

Морфология. Воздушный мицелий диаметром около 0,7-1,0 мк, разветвленный, умеренно прилипщий -к среде, белый.

Субстратпый мпцелий немного тоньще, чем воздушный; диаметр около 0,5-0,7 мк, имеет тенденцию проникать в агаровую среду.

Иа поверхности агаровой среды, часто наблюдается скопление из куполообразиых образований.

отдельные споры, но главным образом цепочкп из 2-10 спор. Цепочки прямые, сравнительно легко разделяются на отдельные споры и при выращивании со встряхиванием не наблюдается цепочек длпнпее, чем из 2-3 спор. Спиральные не образуются.

Ир1 прорастанни спор наблюдается 1 - 2 трубчатых зародыша.

Фрагментов мнцелня в чашках Иетри не наблюдается, но часто встречаются фрагменты в 5-20 мк при намазывании на стекло.

Как показывает хроматографический анализ на бумаге после гидролиза клеточной оболочки 611-НС клеточная оболочка состоит из мезо-сх, е-диаминоиомелиновой кислоты, арабинозы, галактозы и т. д.

Физиологические признаки. Иа сахарозонитратном агаре не растет.

Иа глюкозо-аснарагиновом агаре не растст.

Иа глицерин-асиарагиновом агаре рост умеренный. Иа новерхности среды образуются тесные слои. Субстратный мицелий светло-коричневый. Воздушный -мицелий белый. Иа жидком агаре рост хороший. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелий свегло-коричневый. Растворимого пигмента пег. Среда имеет порошковатую поверхность.

сти среды. Иа второй день разжижения студня не наблюдается, но на четвертый день наблюдается умеренное разжижение.

Среда Беннета. Хороший рост. Воздушный .1Нцелий белый. Субстратный .мицелий светло-корнчневый. Растворимый нпгмснт сиетло коричневого цвета.

Агар с кра.хмалом н неорган.ичсскимн с(.о1м.M1I. Через чет1)1ре прн 50 С роста нег. Разжнжен 1я К15а.мала нет.

Лгар с кра.х.малом н .мясным нентоно.м. Хо) рост. Воздунпчый мнцелнй бельп. Субстратный мнне.пн сБ(ЛЛ())нч 1еиы| 1. Растворимы HHiMCHi, ciiei;i()-i(.)pH4Hc-Bbii i. -1ере,ч два дня Hpii 50 С крахмал нолностыо гидро:1нзуется,

Декстрнно-казе1П оиый агар. Хороший pi;cT. Воздуншый .пIнeлий желтовато-белый. Растворимый н HIмен т светло-желто-кор1 ЧневыГ|.

1 нтратиая среда. Тонкий нлснкообразшл рост. Воздушный М1 нс;1нй бе.лый.

Ьгграт не восстанавливает.

Па .laK.M coBOM молоке )астет с образо1(аинем колец. Через два-дня н)и 50 С иаб.тюдается нег|тоннза1дня. /

Па 1.:артофельно1 1 массе роста нет.

11,е.1люлозо-аснарагн110Бая С1)еда. Роста нет. Целлюлоза не разла1ается.

1.,е, люлозо-декстрш-10-казеиио1 аясреда.

Умереиный рост в внде колоний. Возду Н1Н 1| 1 мнцелнй белв1Й. Почти не наблюдается раз.тоження неллю;10зы.

Па нитггге.ииюГ агаровой с)еде Hei роста нрн 30, слаб1,1Й рост нрн о7, ме1)енный нри 40-45 и ,) рост нри 40 - 45С. .Умс|)снН1) рост, но слабое сцсн,тение воздушного мицелня нрн 55--60 С н нло.хой рост нрн 65° С.

Споры не по1 1бают нри тенловси: обрабоп;с в теченне 10 мин нрн 100 С. При экстракщш горячим 80%-ным этаноло.м наб.тюдастся нрнсутхтвнс 2,6-днноколеииовой кнс,К)Т1). Этот факт не наблюдается для нзвеспюго )ода.

Г1итател1Л1ая ереда, ирименяе.мая .нрн предложенном стюсобе, соде1)Ж1гг источники у1лерода, азота, HeojiraiiiniccKHx солсм : и opraiiHMcски.х нитательн1 гх вен1еств. Источником углс л)да можег быт1) нолн.мер, и.мею1цнй с|)авннтельно высокую стенень но.;1И.мери:;ацн11, нанример крахмал, декстран, декстрнн, ннулнн II т. н., но са.хара, имсюшие ннзкую степень но,тимернзацнн, наиример, .моноса.ха)1ды, днса.харнды н т. н. непригодны. Псгочииками азота .может бвггь сульфат ал1моння, х.торн.ц аммония, фосфат а.м.моиия, нитрат аммония н т. II. Меорганнческие соли добавляются к среде в качестве источников разлнчны.х э.те.ментов, существенных для роста мнкроорганизма II . нредетавлять нодходяшую комбинацию различных фое11)атов, 1 алийиых, ма1незиальных, цинковых, медных, железных, марганцевых и т. и.солей. В качестве ор аи 1ческнх ннтате; ьиых веществ добавляют такнс вещества, как витамннв, аминокислоты, дрож}кевой н солодовы) .экстракты н т. д,.

Среда может также состоять нз сущесгвенно важных неорганических солей и живых клеток некоторых дрожжей, хлореллы, грибков, бактерий и т. д., которые иодвергаютея действню (рерме гга настоящего изобретения. В последнем случае живые клетки служат в качестве источника углерода, азота и нитательных вендеств, но лучшие результаты могут быть ;.;остигнугы, если к среде добавляют

дрожжевой н солс довый экстракт и т. д.

Вырашивание обычно начинают суспендированием Micropolys рога 434 в стерилизованной воде нутс.м Hepeiifica нетле11 и.татиновой 11ГЛ1л чисто11 ку;|ьтурв1 и дсгЗавлеиия нолучаюшейся суснензнн к нитательной среде онисацного выше тина. Выращивание обычно заканчивают за период 1( -48 час с аэрированием нри температуре 40--60°С.

Фер.меит накапливается во время выращивания в ку,тьтуральной жидкости и верхний слой носле удаления мицелия, ианример, центрифугироваиием, .может применяться как таковой для лпзир( клеточной оболочки или может высушиваться ири темнературе ниже 0°С для получения его в виде порошка.

Для нолучения более очищенного ирепарата раствор неочищенного фермента высаливают сульфатом аммония или обрабатывают

ацетоном для оеаждения фермента. Высаливание производят цуте.м добавления сульфата а.м.мслшя к расгвору фермента до етенени насыщения 0,4, удаления образова;вшегося оеадка, да.1вне1 1шего дс,баво1еиия до стеиени наеы|цс1111я 0,G и собнрания осевшего фермента. Добавлять сульфат аммония можно за один прием. Лучшие результаты в этом случае по.чучают, если сульфат аммония добав 1яют до етенени насыидеиия 0,8. С другой стороны для

осаждения фермента .можно обрабатывать раство) ацетслю.м. Панлучшнй результат получают нрн .медленном добавлении ацетона до концентрации 60% н отделении оеадка после ие1)емещнвання в течение 1 час. Полученный

фер.меит раство|зяют зате.м в подходящем буферном растворе, например в 0,01 п. растворе КНгРО., (,0) и диализируют в тот же буферный раствор. Внутренний раствор (расiBop, остаюнипкя в .мешке из мембраны после

диализа) иредставляет высоко чистый раствор фермс1гга, его можно высушить нри темлературе ииже 0° С аналогнчно неочищенному раствору фермента.

Г1)едложенньи1 литический фермент имеет

следующие характеристики.

Устойчив в пределах рП 5,0-9,0. Оптимальный предел рП 7,0-8,0.

УХктивеи ири температуре 40-70° С, в особенности :нрн 50-60° С.

Будучи сюйкнм нри низкой температуре, он не дезактивн)устся нрн 0 С и теряет активноеть нри 100°С за 10 мин.

Hg++, Fe++, Zn++, Cd++, Ni++ и умеренно Mn++, Co++, HO активируется и Mg++.

Полученный литический фермент пригоден для экстрагирования многих полезных внутриклеточных веществ, например протеина, нуклеиновой кислоты, аминокислот, витамина и др.

П р и м е р 1. В среду А производят посев Micropolys рога 434. Среда сОхТ,ержит 5 г живых клеток Candida rugosa IF-101; 1 г KsHPO ; 0,5 г MgSO.,. УНаО и 1000 мл дистиллированной водЕл; рН 7,4. Выращивают со встряхиванием 24 час три 50-55° С, после чего живые клетки Candida rugosa IF-101 полиостыо растворяются. Полученную культуральную жидкость затем центрифугируют при 5000 об/мин iB течение 10 мин, клетки и споры Micropolys рога 434 удаляют. Получают неочищенный раствор фермепта, обладающий большой активностью но растворению клеточной оболочки.

Готовят суспензию живых клеток каждого вида дрожжей, перечисленных в табл. 1, с концентрацией 10 мл, содержащую 0,1% K2lIP04 и 0,05% MgSO.|-7H20 в дистиллированной воде и рН доводят до 7,4. Применявшиеся дрожжи, содержащие живые клетки, получают посевом этих дрожжей в среду, содержащую глюкозу, (NH4)2SO.,, КЫгРО.,, MgSO4, сололювый и дрожжевой экстракты, и.1еющую рП 5,4. Выращивают их встряхиванием 24 час при 30° С.

Затем после доведения неочищенного раствора до рН 7,4 к каждым 3 мл этого раствора добавляют 0,2 мл суснензии живых клеток и смесь слегка встряхивают 4 час при 50° С, Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что большая часть дрожжевых клеток разрушепа и растворена.

Уменьшение мутности реакционной смеси, указанное в табл. 1, определяется визуальио. Три :плюса обозиачают полное растворение клеток, два плюса - умеренное растворение и один плюс - слабый лизис клеток.

Степень лизиса клеток вычисляют по следующей формуле: где Si - исходное число клеток; Sa - ЧИСЛО иелизироваппых клеток, тающихся в реакционной смеси. Пример 2. В стерилизованную при 120°С в течение 3 мин среду Б, содержащую около 10 г увлажненных клеток Chlorella ellipso idella tamiga; 1 г K2HPO4; 0,5 г MgS04X7H,O и 1 г дрожжевого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды с рН 7,4 засевают мицелий Micropolys рога 434 и выращивают при 50° С 24 час. Нелизированные клетки Chlorella удаляют центрифугированием для получения неочищенного раствора фермента, который имеег большую активность по лизированию живых

Таб.)1нца 1

К 3,0 мл нолучепного таким образом раствора добавляют 6,2 мл суснензии клеток Chlorel1а (3x10 мл) и смесь выдерживают при 50°С в течение 18 час прп легком встряхивании. Полученные результаты показап1л в табл. 2, где мутность даиа в велпчипах оптической плотности, измеренной при длине .волны 530 ммк. Стандартный раствор готовят путем добавления к суснепзии Clilorella фосфатного буферного раствора (рП 7,4) вместо раствора фермента в количестве равном раствору фермента.

Таблица 2 П р и м ер 3. К неочищениому раствору фермента, полученному как в примере 1, добавляют сульфат аммоиия до степенн насыщения 0,4. Образовавшиеся осадки удаляюг и сульфат аммония добавляют до стенеии иасыщения 0,6. Полученные осадки собирают центрифугированием и суспенднруют в днстиллированной воде. Суснензию диализировали через целлофановый .мешок для получения очищенного фермента. Полученный очищенный фермент добавляют к жидкому образцу, содержащему мицелий Aspergillusorizal IAM 2024. После выдерживания смеси при 50° С в течение 4 час большая часть клеточных оболочек мицелия была разрушена.

3 мин, добавляют 2,0 мл раствора фермента, полученного в нримере 3.

После доведения рН до 7,4 смесь выдерживают 4 час при 50°С. Около 70% клеток было разрушено.

Пример 4. В среду В (содержан1ую 20 ; крахмала; 2 г (МП,),SO.,; 2 г КНаРО,; 5 г К2НРО.,; 2 г MgSO., 7Н2О; 0,006 г CuSO,,бНгО; 0,001 г FeSO4-7H2O; 0,008 г МпСЬ 4Н2О; 0,002 г ZnSO.,-71-120 и 10 г дрожжезого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды -при рП 7,4) засевают Micropolys рога 434 и вырааитвают при встря.хиваини при 50° С в течение 24 час.

Культуральиую жидкость центрифугируют при 5000 об:мин 10 мин. Мицелий и споры удаляют и получают раствор неочищенного фермента, обладающий большой активностью но лизироваиию клеточиых оболочек.

К получеиному раствору иеочнп;енпого фермента добавляют сульфат аммоння до степени наеыщепия 0,8 и смесь :перемешивают 4 5 час при 5°С, при это.м 1получа1от коричненып осадок. Последний отделяют центрифугированием при 10000 обIмин, растворяют в 90 мл 0,01 М раствора фосфатного буфера (рП 7,0) н днализируют в тот же буферный раетвор при 5° С. Получают раствор очищенного фер.мента, который высущивают при низкой температуре. Получают 195 г чистого фермента в виде порощка.

П р и м е р 5. К раствору неочищенного фермента, полученного как в примере 4, поддерживаемому ири 5° С, добавляют ацетон при перемещиваиии до достижения ацетоном 60%-ной концентрации и продолжают перемешивание 5 час. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 10000 об лшн 10 мин и растворяют в 90 мл 0,01 М раствора фосфорного буфера (рП 7,0). Полученпый расччюр днализируют в тот же буферный рас1В(зр ири 5° С и получают раствор очищенного фермента.

Предмет изобретения

1.Способ нолучения литического фермента нуте.м выращивання его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в присутствии .минеральных солей е гюследующи.м выделением фермента из культуральиой жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента иснользуют микроорганизм Micropolys рога 434.

2.Способ но 11. 1, отличающийся тем, ч го вырандивание осуществляют при температуре 40-60° С в течение 16-24 час.