СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТОНОВ Советский патент 1974 года по МПК G01N27/26 

1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в цитологии, генетике и биохимии.

Известен способ определения гистонов путем их электрофоретического разделения и выявления белковых зю.п (Красителем амидочерным. Однако этом способ ,не позволяет выделять фракции с определенным аминокислотным составом.

Целью изобретения является обнаружение фракции гистонов, богатой лизипом. Для этого электрофореграммы, отмытые от избытка амидо-черного, обрабатывают в растворе частич«о полимеризованного красителя тиазинового ряда, например, толуидинового синего.

Пример 1. На первом, этапе известным образом получают электрофореграмму гистонов на 15%-ном полиакриламидном геле, которую окрашивают в 1%-ном растворе амидо-черного в смеси :метанол-уксусная кислота-вода (в соотношении 5; 1:5) в, течение часа при комнатной температуре. Затем блок геля с проявленной электрофореграммой отмывают от избытка амидо-чериого в 1н. растворе уксусной кислоты в течение 24-48 час, меняя экстрагирующую среду через каждые 3-4 час. Конец экстракции определяют визуально по достижению бесцветного фона.

Дальнейшую обработку проводят следуюш,ИМ образом.

2

В 100 мл дистиллированной воды вносят 50 мг толуидинового синего (ЧДА) и перемешивают при нагревании или выдерживают при комнатной температуре несколько суток. В полученный 0,05%-ный раствор микронипеткой по капле вносят 0,15-0,20 мл 0,1%--ного раствора рибонуклеиновой кислоты (РНК) в 0,05 М ацетатом буфере (рН 5,5) встряхивая до выпадения частично полимеризованного на РНК красителя в виде фиолетово-синих хлопьев. Суспензию выдерживают в течение часа прм комнатной температуре, после чего осадок отделяют центрифугированием, дважды промывают водой, заливают осадок 1 в.

раствором уксусной кислоты и через 1-2 час смесь BiHOBb центрифугируют, отбрасывая осадок. Полученный прозрачный -раствор roroiB к использованию для о.К1раски электрофореrpaiMiM.

В указанный раствор погружают блок полиакриламидного геля, полученного на первой стадии, на 1-2 часа, отмывают в 1 н. растворе уксусной кислоты в течение 12-24 час, меняя среду через каждые 3-4 час, « используют для анализа известным образом. Богатые ЛИЗИ1НОМ фракции гистонов имеют красно-фиолетовый цвет на фоне темно-синих зон, свидетельствующих о присутствии прочих белков. Пример 2. Все операции но подготовке

электроферограммы, окрашеппой амидо-черным, и их обработке раствором частично полимеризованного красителя тиазинового ряда производят, как в примере 1.

Раствор красителя приготовляют следующим образом (по экспресс-методу). Известным образом готовят блоки чистого 10-15%ного полиакряламидного геля объемом 2000- 2500 мм в виде прямоугольных параллелепипедод (В данном случае размер 60x20X2 мм), которые в течение 30-60 мия пропитывают 0,5%-ным раствором РНК в ацетатном буфере, после чего быстро споласкивают водой. Затем эти блоки на 20 мин -погружают в 0,05%-ный водный раствор толуидииового синего и вновь споласкиВают водой. После выдерживаяия в течение часа 0|бработа:нных таким образом блоков в 1 н. уксусной кислоте получают требуемый |реакти1В в .виде раствора.

В этом случае яркость окраски по сравнению с результатами обработки по примеру 1 повышается. Упрощается и ускоряется процесс подготовки окрашивающего раствора. Срок хранения в среднем 3-4 недели, возможно использование в течение трех .месяцев.

Готовые электрофореграммы хранят в 1 н. растворе уксусной кислоты.

Предмет изобретения

Способ определения гистонов путем их электрофоретического разделения и выявления бел1ковых зон красителем амндо-черным, отличающийся тем, что, с целью обнаружения фракции гистонов, богатой лизином, электрофореграммы, отмытые от избытка амидо-черного, обрабатывают в растворе частично полимеризованного красителя тиазинового ряда, например, толуидинового синего.