О П И С А Н И ИЗОБРЕТЕНИЯ Советский патент 1973 года по МПК G01N29/26 G01N33/02 G01N27/26 

1

Известен способ количественного определения содержания белковых фракщий в .биологических л ид«остях, например молоке, включающий электрофорез, окрашивание электрофорепрамм, отмывку их, элюированне связавшегося с белком красителя н определение экстинкцин элюнрованного «расителя.

Известный способ .предусматривает бумажный электрофорез с последующим элюи рованием связанной с протеином краски и определение экстннкции. Однако посредством бумажного электрофореза невозможно получить точное разделение белковых смесей на фракции.

Предлагаемый способ повыщает точность и значительно ускоряет разделение белковых смесей на фракции н количественное определение содержания протеина в электрофоретичеCKiH различи.мых фракциях.

Достигается это тем, что перед электрофорезом пробу разделяют на две части и в одной из них осуществляют электрофорез на крах:мально.м теле, а в другой определяют содержание общего белка, например, методом Кьельдаля. после электрофореза гель разрезают на фракции и нахадящиеся против них контрольные участки такой же площади, лишенлые белка, при этом экстинкцию кусочков геля с отдельными фракциями определяют против элюата из соответствующего участка геля, лишенного белка, элюирование проводят насыщенным

раствором мочевины, а по экстинкции определяют соотно)нение белковых фракций с последующим пересчетом их процентного содержания -на содержание белка в каждой фракции. Электрофореграмму окрашивают в .насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5. Для количественного определения белковых

фракций берут 5,0 г молока, в 10 мл осуществляют электрофорез, а в оставшейся части определяют содержание общего белка н казеина по Кьельдалю. Пробу обезжиренного молока для электрофореза подвергают разделению :на вывороточные белки .и казенны при изоэлектрической точке казеинов. Сыворотку отфильтровывают на бумаж.ном фильтре, после чего казеин промывают четыре раза водой, четыре раза этанолом, два раза ацетоном и два раза этиловым эфиром.

Навеску казеина в количестве 20 мг растворяют в 1 лгл буферного раствора, применяемого Д.1Я заварки геля.

Разделение белков молока на фракции проводят методом горизонтального электрофореза в крахмальном геле с прерывистой системой буферов.

В качестве электролитного буфера используют раствор, состоящий из 11,8 г борной кислоты н 2,1 г ппдрата окиси лития на 1 л электролита; в качестве гелевого буфера - раствор, содержащий 8, 67 г тригидраксиметиламшюметана и 1,5 г лимонной кислоты на 1 л геля. К каждому литру гелевого буфера добавляют 190 мл .электролитного, а затем мочевину до 6,6 М. К буферу с мочевиной перед заваркой до бавляют 2-меркаптоэтанол лз расчета 2 мл на 1 л. Гель готовят из 14,5% взвеси частично гидролизОВаиного крахмала ,в буфере путем заварки на открытом пламени с последующим удалением пузырьков воздуха под вакуумоМ.

В пластину геля размером 13,5X20X0,6 слг на кусочКах фильтровальной бумаги размером 6X7 Mtii вносят по три образца нативного казеина и сыворотки от каждой пробы молока.

После электрофореза гель разрезают с помощью устройства, обеспечивающего получение «ижней «чистой пластины с равномерной по всей площади толщиной в 3 мм. Фореграмму окращивают в течение 15 мин в «асьпценном растворе амидо-вого си1пе-черпого красителя в жидкости, состоящей пз метанола, уксусной кислоты и воды в пропорции 5:1:5. Жидкость без красителя применяют для отмывки фореграмм.

Хорошо отмытые фореграммы обсушивают фильтровальной бумагой и разделяют по фракциям специально изготовле-нпыми пробойниками. На каждый образец сыворотки или казеина вырезают свой контрольный участок, свободный от белка. Таким образом, каждая фракция одной пробы представлена трижды, что значительно увеличивает точность способа.

Кусочки геля помещают во флаконы объемо51 10 мл и наливают 5 мл насыщенного раствора мочевины. Элюирование продолжается 72 час, из «их 48 час при комнатной температуре и 24 час в термостате при 37°С.

Э;кстинкцию элюата определяют на спектрофотомет|ре дри 625 нм против контроля - элюата гелевой пластинки с фоном. Сумму показателей экстигнкции по каждой пробе принимают за 100%, показатель эксткниции каждой

фракции пересчитывают в процентах по отнощению к сумме. Количество белка в сыворотке вычисляют по разности между общим бел-ком и белком «азеяна.

Зная количество белка в цельном «азеи-не и сыворотке, а также процентное соотнощение содержания белка в сывороточных и казеиновых фракциях, рассчитывают содержание протеина во всех электрофоретически различимых фракциях молока.

Предмет изобретения

1.Способ количественного определения содержаиня белковых фракций в биологических жидкостях, например молоке, включающий э л ектр о ф орез, о кр аш ив а н и е эл е:ктр оф орегр а м м, отмывку их, элюировапие связавщегося с белком красителя и определение экстинкции элюированиого красителя, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности разделения белковых смесей на фракции и повышения точности определения, перед электрофорезом пробу разделяют .на две части и в одной из них осуществляют электрофорез на крахмальном геле, а в другой определяют содержание общего белка, например, методом Кьельдаля, после электрофореза гель разрезают на фракции и находящиеся против них такой же площади контрольные участки, лишенные белка, при этом экстинкцию кусочков геля с отдельными фракциями определяют против элюата из соответствующего контрольного участка геля, лищенного белка, элюирование проводят насыщенным раствором мочевины, а но экстшжции определяют соотношение белковых фракций с последующим пересчетом их процентного содержания на содержание белка в каждой .

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что электрофореграмму окрашивают в насыщенном растворе амидового сине-черного красителя в жидкости, состоящей из метанола, уксусной кислоты и воды в соотнощении 5:1:5.