СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ РЕАКЦИЙ Советский патент 1974 года по МПК C12Q3/00 

1

Известен способ исследования серологических реакций, путем определения интенсивности образования комплексов антиген -f- антитело по изменению теплофизических характеристик среды, регистрируемых терморезистором.

Целью изобретения является получение количественной характеристики кинетики реакции. Это достигается тем, что источник тепла и детектор, работающие в импульсном режиме, помещают непосредственно под поверхностью раствора, в качестве источника тепла и детектора используют два разных элемента, и по скорости прохождения тепловых импульсов между ними судят о кинетике реакции.

В исследуемую среду непосредственно под ее поверхностью помещают точечный источник тепла и точечный температурный детектор и, подавая кратковременные тепловые импульсы через равные промежутки времени, регистрируют моменты наступления максимума температуры в микрорайоне температурного детектора; по скорости прохождения тепловых импульсов судят о кинетике протекающей серологической реакции.

В простейшем случае кинетика серологической реакции может быть описана выражением

где «/)(/)-концентрация комплексов антиген- антитело в момент времени i

(ПН)Р - равновесная концентрация комплексов антиген - антитело;

KZ - константа скорости реакции. С другой стороны, концентрация комплексов антиген - антитело связана с теплопроводностью среды, в которой протекает серологическая реакция, установленной зависимостью

K(t} K,L)ik(t),(2)

где K(t)-коэффициент теплопроводности среды в момент времени / после начала комплексообразования;

Ко - Коэффициент теплопроводности среды в начальной момент времени;

nh(t)-концентрация комплексов антиген - антитело в момент времени t

L - параметр, зависящий от структуры, характерной для данного типа серологической реакции. Подставляя в уравнение (2) значение л. из формулы (1) учитывая, что (здесь X-коэффициент температуропроводности среды, р и с - плотность и удельная теплоемкость среды), получаем где x(t)-значение коэффициента температуропроводности в момент времени t; XQ - начальное значение коэффициента температуропроводности; -VIBH -значение коэффициента температуропроводности в момент наступления равновесной концентрации комплексов антиген - антитело. При этом предполагают, что изменения р и с пренебрежимо малы. Значение коэффициента температуропроводности для любого заданного момента времени легко определяется по скорости прохождения теплового импульса для этого момента времени3(2,„--) где г - расстояние между точечным источником тепла и точечным температурным детектором; tm - время наступления максимума температуры в микрорайоне детектора; тГ- длй -лет-юсть теплового импульса. фор1 гул|й (4) получается при решении уравнения теплопроводности в предположении импульсного точечного источника тепла. Изменение скорости прохождения теплового импульса Б среде для заданного момента времени занимает не более 20-25 сек. Это позволяет производить многократные замеры в течение времени протекания серологической реакции (15-30 мин). Размещение точечного источника тепла н температурного детектора непосредственно под поверхностью среды исключает влияние тенловой конвекции жидкости. Пример исследования кинетики при постановке реакций для трех иммунологических пар: цельная сыворотка больного туберкулезом сухой очищенный туберкулин, взятый в разведении 1:10; цельная сыворотка кролика, иммунизированного альбумином -}- альбумин в разведении 1:1000; гипериммунная сыворотка -j- диагиостикум клещевого энцефалита в разведении 1:16. В качестве точечного источника тепла используют микротерморезистор типа МТ-54 (сопротивление с 500-700), способный выдерживать кратковременные токи больщой мощности (до 1,0-1,5 вт). Точечным температурным детектором служит также Рушкротерморезистор Л1Т-54, работающий в режиме электротермометра. В фарфоровую кювету заливают по 0,5 см сыворотки и антигена и тщательно перемеп1ивают. Микротерморезисторы укрепляют в стационарной подставке на расстоянии 4 мм один от другого и погружают в реакционную смесь на глубину 1-2 мм от поверхности. Терморезистор, работающий в условиях точечного источника тепла, подключают через электронное реле времени к источнику питания. Терморезистор- детектор включают в мостовую схему Витстона, к диагонали которой подключают регистрирующий прибор. Перед началом измерений мост уравновещивают. Затем на терморезистор - источник тенла, подают в течение 2 сек ток мощностью 1,2 ВТ и, терморезисторо.м - термометром, измеряют время наступления максимума температуры. Тенловые импульсы нодают через равные промежутки времени 2-3 мин. Измерения нроизводят в течение 30 мин. В жидкостях, в которых нет серологической реакции (контроль), время tm остается почти постоянным. Например, для физраствора ,0±0,2 сек, для нормальной сыворотки + диагностикум - ,3±0,3 сек. В жидкостях, где протекает серологическая реакция, время tm постепенно возрастает, что указывает на уменьшение коэффициента тс.мпературопроводности среды. Полученные в результате замеров данные г, т и /т подставляют в формулу (4) и вычисленные значения X:(t} наносят на график, где по оси абсцисс откладывают время, по оси ординат- значение %. Математическая обработка экспериментальных кривых дает эмпирические формулы вида Т W -: fpaBH. (1 - ), где Y(0 -7;«fe() -относительная концентрация комплексов: для первой иммунологической пары 7(.27(); для второй иммунологической пары (0 (1-е-°°); для третьей иммунологической пары 7(0 0,27(1-е-о.°«0Исследуя полученные результаты, можно сделать следующие выводы: равновесная относительная концентрация комплексов антиген - антитело оказалась одинаковой для первой и третьей иммунологических пар: 7равн 0,27. Для второй им.мунологической пары она оказалась ниже 7равн 0,165; наибольщая константа скорости реакции характерна для первой иммунологической пары (К.т 0,147 ), а наименьшая - для третьей иммунологической пары (/(г 0,043 ). Анализ кривых ноказывает, что через 30 мин после начала реакции для первой пары реакция практически закончилась, а для второй и третьей пар она еще далека до завершения. Обычные серологические методы титрования дают конечную величину преципитации (что эквивалентно равновесной концентрации комплексов), и они показали бы обыкновенную характеристику для первой и третьей иммунологических пар. Исследование кинетики реакций и определение констант скорости реакции указывают на существенную разницу в реакциях первой и третьей иммунологических пар, которая, повидимому, связана с различной разновидностью антигенов и антител. 5 Предмет изобретения Снособ исследования кинетики реакций, например серологических, путем определения интенсивности образования в растворе комплексов аптнгеп -}- антитело по изменению теплофизических характеристик раствора с помощыо источника тепла и детектора, от л ич а ю ш, и и с я гем, чю, с целью получения ко6личественной характеристики кинетики реакции, источник тепла и детектор, работающие в импульсном режиме, цомещают непосредственно под поверхность раствора, в качестве источника тепла и детектора используют два разных элемента, и но скорости прохождения тепловых импульсов между нпми судят о кинетике реакции,