Способ биосинтеза амидаз Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к области микробиологической промышленности, а точнее к биосинтезу амидаз, преимуп ественно /-аспарагииазы и бензилнеиициллинацилазы.

Известен способ биосинтеза амидаз путем непрерывного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Escherichia coli на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.

Недостаток известного способа заключается в том, что проводимый процесс не обладает стабильностью при изменении скорости иротока. Кроме того, для культивирования микроорганизмов используют питательную среду иа основе дорогостоящего дрожжевого экстракта без Сахаров при иоддержаиии в строго определенных концентрациях лимитирующего субстрата, в качестве которого используют промежуточные продукты, например, глюкозу или глицерин, вследствие чего изменение содержания глюкозы в исходной среде с 1,5% до 1,75% снижает выход продукта на 20%, а изменение скорости протока с 0,15 час до 0,28 приводит к уменьшению съема фермента в 50 раз.

С целью обеспечения стабильности процесса по предлагаемому способу культивирование осуществляют при поддержании парциального

давления кислорода в среде не выще 2 мм рт. ст.

Способ осуществляют следующим образом.

Биосинтез амидаз, например /-аснарагиназы и бензилпенициллииацилазы, проводят в условиях непрерывного одностадийного культивирования аэробных микроорганизмов, например, Escherichia coli штамм 980, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости. Культивирование осуществляют при иарцноиальном давлении кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.

Способ аиробирован в лабораторных условиях.

Пример 1. Проводят биосинтез бензилпенициллинацилазы, используя штамм АТСС 9637 Escherichia coli. Культуру поддерживают в пробирках со скошенной агаризованной питательной средой из 2% (по сухому весу) кукурузного экстракта и 1,5% агар-агара. Пробирки инкубируют 18 час при 37°С.

Засев осуществляют смывом с косяков из расчета 0,12 мг клеток (по сухому весу) на 1 мл питательной среды, в качестве которой используют 1 вес. % раствора кукурузного экстракта с добавлением 0,1 вес. % фенилуксусной кислоты, рН 7,2-7.3 после стерилизации.

Непрерывное культивирование проводят в аппарате тнпа MRB при объеме загрузки 1 л при 24°С. Содержание растворенного кислорода определяют датчиком. Поток питательпой среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 2-4 час после засева. После включения протока подбирают условия аэрации и перемешивания таким образом, чтобы парциальпое давление растворенного кислорода пе превышало 2 мм рт. ст. Этому требованию соответствуют скорость вращепия двухлопастной магнитной мешалки 900 об/мин и расход воздуха - 0,8 л/мин.

Непрерывную ферментацию бензилпенициллинацилазы проводят 100 час.

При протоке среды 0,15 час (150 мл/час) получают культуральпую жидкость с содержанием клеток 1,5±0,1 мг/мл с удельной активностью фермента 13,0±0,5 ед/мг сухого веса клеток, - а при протоке 0,1 час (100 мл/час) - с содержанием клеток 1,8+ 0,1 мг/мл с удельной активностью 16,0± 0,5 ед/мг сухого веса клеток.

Активность фермента определяют модифицированным методом Сватека.

Контрольный периодический процес ведут 18 час на той же среде и том же посевном материале в колбах Эрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл стерильной среды при 24°С на круговой качалке при скорости вращения 220 об/мин. К концу процесса получают 3,8 мг/мл клеток с удельной активностью 7,2 ед/мг сухого веса клеток.

Таким образом, производительность непрерывного процесса съема фермента с единицы объема загрузки питательной среды в единицу времени практически не изменяется при изменении протока в 1,5 раза и составляет, примерно, 0,3 ед/мл час против 0,15 ед/мл час в периодическом процессе (без учета времени на подготовку аппарата к ферментации в последнем).

Удельная активность фермента увеличивается в 2-2,5 раза, что способствует повышению производительности на стадии химической очистки бензилпенициллинацилазы.

Пример 2. Проводят биосинтез /-аспарагиназы, используя штамм 980, полученный в лаборатории культур продуцентов ВНИИА. Культуру, хранившуюся на мясо-иептонном агаре, используют для засева колб с посевной стерильной средой, в качестве которой берут 4 вес. % кукурузного экстракта и 0,1 вес. % гидролизата казеина (по аминному азоту).

Посевной материал выращивают на круговой качалке (220 об/мин) 15-18 час при 28°С. Питательные ферментационные среды засевают посевным материалом из расчета 0,1 - 0,5%.

Биосинтез /-аспарагиназы проводят на среде, содержащей 8 вес. % кукурузного экстракта и 0,1 вес. % сульфата аммония, рИ стерилизации 7,3-7,5.

Непрерывное культивирование ведут в ферментере типа FL-103 (Biotes) при объеме загрузки 2 л при 28°С. Растворенный кислород змсряют с помощью прибора LP-100-8 (Biotes). Проток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 3-5 час после засева. Условия аэрации и перемешивания соответствуют поддержанию парциального давления кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст. Непрерывную ферментацию /-аспарагиназы

проводят 160 час при протоке среды 0,5 час- расход воздуха 2 л/мин, скорость вращения мешалки 575 об/мин. Получают культуральную жидкость с содержанием клеток 3,3± 0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 1,5±0,1 МЕ/мг клеток Iаснарагиназы.

При протоке среды 0,25 час (0,5 л/час) поддерживают расход воздуха 2 л/мин и скорость вращения мешалки 420 об/мин, при

этом получают культуральпую жидкость с содержанием клеток 3,5±0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 2,8± 0,2 ед/мг сухого веса клеток.

Контрольный периодический процесс проводят в колбах Эрленмейера (750 мл) с загрузкой 100 мл среды при на круговой качалке нри 220 об/мин. На 15 час культивирования получают 4,1 мг/мл клеток с удельной активностью фермента 1,6 ед/мг сухого

веса клеток.

Таким образом, производительность непрерывного процесса практически не изменяется при изменении протока в 2 раза и составляет 2,5 ед/мл в 1 час против 0,65 ед/мл в

1 час при периодинеской ферментации, т. е. примерно в 4 раза выше, даже без учета времени на вспомогательные операции в последнем. Пример 3. Процесс биосинтеза /-аспарагиназы ведут, как в примере 2, используя штамм С1 Escherichia соИ.

Ферментацию проводят 100 час, последовательно заменяя через каждые 36 час культивирования питательную среду, приготовленпую на основе трех различных партий кукурузного экстракта с содержанием углеводов 13 последнем 0,7, 2,4 и 4,2% (по сухому весу экстракта). При протоке 0,25 час (0,5 л/час) расход

воздуха 1,5 л/мин, скорость вращения мешалки 450 об/мин. Получают культуральную жидкость с содержанием клеток 3,3±0,2 мг/мл (по сухому весу) при удельной активности фермента 3,,2 ед/мг сухого веса клеток.

В контрольном периодическом процессе на 18 час культивирования получают 3,65 мг/мл клеток с удельной активностью 3,8 ед/мг.

Пример 4. Для биосинтеза /-аспарагиназы используют культуру Erwinia carotovora,

которую поддсрЛСивают на скошенном мясопептонком агаре к засевают колбы с посевной стер: „ ьной средой, в качестве последней используют 4%-ный кукурузный экстракт (по техппческому весу), 0,1%-иый гидролизат казеипа (по амипиому азоту). Посевной материал выращивают на круговой качалке 15-- 18 час при 37°С. Питательные ферментационные среды засевают посевным материалом в количестве 0,1-0,5%.

Биосинтез /-аспарагиназы проводят на ереде, содержащей 8 вес. % кукурузного экстракта, 0,1 вес. % сульфата аммония, рН для стерилизации 7,5. Непрерывное культивирование ведут в аппарате типа MRB, загружая 1 л при 37°С. Содержание растворенного кислорода контролируют датчиком ВНИИА. Поток питательной среды включают в фазе экспоненциального роста культуры через 5 час после засева. После включения протока устанавливают условия аэрации и перемещивания таким образом, чтобы парциальное давление кислорода не превышало 2 мм рт. ст. В данном примере этому соответствует скорость вращения мещалки 1100 об/мин и расход воздуха 1 л/мин. Непрерывную ферментацию проводят 120 час.

При потоке среды 0,5 (500 мл/час) получают культуральную жидкость с содержанием клеток 1,3±0,1 мг/мл с удельной активностью фермента 9,0±0,5 ед/мг сухого веса клеток. При протоках 0,25 час- и 0,15 час-1 содержание клеток в вытекающей культуральной жидкости 1,8+0,1 мг/мл с удельной активностью 12,0±0,5 ед/мг сухого веса клеток и 18,5+0,5 ед/мг сухого веса клеток, соответственно.

Контрольный л периодический процесс 15 ЧГС п колол.ч Эрлснме1 1ера объемом 750 мл, загружая 100 кл стерильной среды при 37С на круговой качалке. К концу процесса получают клетки концентраци 2,5 мг/мл с удельной активпостыо 7,8 ед/мг (сухого веса).

Таким образом, производительность непрерывного процесса ие изменяется при колебаниях состава питательной среды и составляет 2,7 ед/мл-час против 0,8 ед/мл-час при периодической ферментации, т. е. в 3,5 раза выще (без учета времени, необходимого для подготовки аппарата к ферментации в периодическом процессе).

Форм у л а изобретения

Способ биосинтеза амидаз путем непрерывного культивирования аэробных MiiKpoopraнизмов, например, Escherichia соИ на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при аэрации с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью обесиечения стабильности процесса, культивирование осуществляют при поддержапии парциального давления кислорода в среде не выше 2 мм рт. ст.