ШТАММ PSEUDOMONAS AERUGINOSA-18 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКТАЗЫ PAE 11 Советский патент 1994 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/385 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в научно-исследовательской практике.

Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего новую эндонуклеазу рестрикции Рае 11.

Штамм Pseudomonas aeruginosa-18 хранится в музее живых культур ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, где штамм депонирован под номером 134.

Характеристика штамма.

Морфология клеток: палочки расположены поодиночке, парами и короткими цепочками. Размер 0,5-0,6х1,5 мкм. Грамотрицательны. Подвижны.

Рост на твердых и жидких питательных средах: на скошенном агаре рост по штриху обильный, нежный, блестящий, приобретает зеленоватый оттенок.

Колонии по чашке Петри с мясопептонным агаром расплывчатые, сероватые, с темным центром и просвечивающим краем. Среда приобретает зеленоватый цвет.

На мясопептонном бульоне и бульоне Хоттингера заметное помутнение, пленка, осадок. Среда становится желтовато-зеленой.

Отношение к кислороду: аэроб.

Утилизация углеводов: глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, маннит культура не усваивает.

Индол и сероводород: не образует.

Желатина, уколом: разжижение.

Чувствительность к антибиотикам: штамм обладает многочисленной резистивностью к антибиотикам. Резистентен к пенициллину, ампициллину, стрептомицину, рифампицину, тетрациклину, биомицину, пуромицину, бацитрацину, колхицину, олететрину, оксациллину, метациллину, спиромицину, нистатину. Чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, антиномицину С, актиномицину Д, полимиксину, гектамицину, митомицину С.

Оптимальные условия выращивания и хранения.

Культура хорошо растет на твердых и жидких питательных полноценных средах: мясопептонном агаре, мясопептонном бульоне, бульоне Хоттингера, среде LB.

Оптимум температуры 37^оС. Хорошо растет при 25-30^оС.

Зона рН роста культуры лежит в пределах рН от 6,5 до 9,5. Оптимум роста культуры и накопления фермента находится при рН среды, равной 8,0. При рН 10,0 культура не растет.

Рабочую культуру пересевают один раз в неделю на МПБ или МПА скошенный. Хранят культуру в лиофилизированном виде в ампуле.

Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Рае 11, получают в том случае, когда штамм - продуцент выращивают на питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл мясного бульона; 10 г пептона; 5 г NaCl; 5 г глюкозы; до 1 л воды.

Существенным фактором выращивания является аэрация. В анаэробных условиях накопление в клетках фермента уменьшается, а уровень интерферирующих неспецифических нуклеаз увеличивается. При культивировании Pseudomonas aeruginosa-18 на синтетических средах выход биомассы и активность в клетках рестриктазы ниже, чем при использовании богатых сред.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы Рае 11 объемом 30-60 мкл содержит 0,01 М трис-НСl, рН 7,4, 0,01 М MgCl₂, 0,001 М дитиотреитола, 1 мкг ДНК фага λ и 0,5-5 мкл фермента. Инкубируют при 37^оС в течение 60 мин. Продукты гидролиза ДНК ферментом определяют электрофорезом инкубационной смеси в агарозном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. За единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фаза при 37^оС за минуту в стандартных условиях инкубационной смеси.

Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках. Полученный фермент проявляет оптимальную активность в присутствии ионов Мg²⁺ в концентрации от 1 до 10 мМ при значении рН 6,6-7,6 при температуре 30-37^оС. Добавление в инкубационную среду NaCl или КСl в концентрации выше 150 мМ приводит к резкому угнетению активности.

Рестриктаза Рае 11 на ДНК фага λ имеет 3 сайта узнавания.

П р и м е р 1. Культуру Pseudomonas aeruginosa штамм 18 предварительно адаптируют на основной питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл мясного бульона; 10 г пептона; 5 г NaCl; 5 глюкозы; до 1 л воды.

Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1: 10, и размножают в условиях аэрации.

Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1: 10 к объему среды при температуре 37^оС в условиях аэрации (2 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 8,0.

Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в интервале 7,5-8,0.

Выращивание продолжают до фазы замедления роста.

Выход сырой биомассы составляет 7 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы Рае 11 2500 ед/г сырой биомассы.

Определение активности фермента проводят экспресс-методом в толуольных лизатах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК.

Выделение эндонуклеазы рестрикции Рае 11.

40 г биомассы Pseudomonas aeruginosa-18 суспендируют в буферном растворе, клетки разрушают путем ультразвуковой дезинтеграции при температуре от 1 до 3^оС. После удаления обрывков клеточной оболочки и неразрушенных клеток фермент фракционирует полиэтиленимином до конечной концентрации 1% , белки осаждают сернокислым аммонием 60% насыщения, осадок растворяют и диализируют. Диализат хроматографируют в калий-фосфатном буфере, в градиенте КСl на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), а затем на колонке с голубой сефарозой.

Получают 50 х 10³ единиц фермента в 40 мл глицеринового буфера. Препарат фермента стабилен в течение не менее 6 месяцев при температуре 20^оС. Фермент пригоден для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 2. Культивирование штамма Pseudomonas аeruginosa-18 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1 л: 10 г триптона; 10 г дрожжевого экстракта; 10 г NaCl.

Выход биомассы 7 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы в биомассе 3000 ед. на 1 г.

После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Рае 11 составил 1350 ед/г биомассы.

Таким образом, биомасса штамма Pseudomonas aeruginosa-18 содержит эндонуклеазу рестрикции Рае 11, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК - CCC GGG, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах.

Содержание рестриктазы в биомассе - 2500-3000 ед. на 1 г сырой биомассы. Для изоизомера Рае 11 - рестриктазы Sma 1 содержание фермента - от 200 до 800 ед. на 1 г сырой биомассы.

Выход очищенного фермента Рае 11 1,25-1,35 х 10³ единиц активности на 1 г сырой биомассы, выход очищенной Sma 1 400 ед. на 1 г сырой биомассы.

Фермент Рае 11 не содержит примесных нуклеазных активностей.

Оптимум рН активности рестриктазы Рае 11 (7, 4) в отличие от рестриктазы Рае 11 (оптимум рН 8,0) позволяет проводить совместные гидролизы ДНК рестриктазой Рае 11 и любой из следующих рестриктаз Sau 3A, Pvu I, Pvu II, Pst I, Msp I, Kru I, Hpa I, Есо R I, а также другими распространенными рестриктазами.

Рестриктаза Рае 11 удобна в генетической инженерии, прежде всего для клонирования фрагментов ДНК по тупым концам при использовании векторов, содержащих уникальный сайт Рае II (Sma I), например, серии плазмид pUC. (56) Roberts T. Nucl. Acids Res. , 12t Suppl. , 167-204, 1984.

Fuchs L. I. , Covarrubias L. , Escalante L. , Sanches, Bolevar F. Gene, 10, 39-46, 1980.

Авторское свидетельство СССР N 1114700, кл. С 12 N 15/00, 1984.

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения является новый штамм Pseudomonas aeruginosa-18 - продуцент новой эндонуклеазы рестриктазы Pae II. Штамм растет на многих углеводах в качестве источника углерода, в качестве источника азота использует мясопептонные бульоны. Аэроб. Синтезирует рестриктазу, расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК-ССС GGG. Содержание рестриктазы 2500 - 3000 ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Pae II 1,25 - 1,35 10³ ед. на 1 г сырой биомассы. Фермент не содержит примесей нуклеаз.

Штамм Pseudomonas aeruginosa-18 - (коллекция Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича МЗ СССР, коллекционный номер 134) - продуцент эндонуклеазы рестриктазы Рае 11.