Способ получения антибиотика Советский патент 1974 года по МПК C12D9/14 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности.

Способ получения антибиотика, нродуцируемого культурой y ctinoplanes sp. NRRL 3884, в патеитной литературе не известен.

Целью изобретения является получение нового антибиотика, активного в отношении ряда микроорганизмов, в частности, кариогенных, а также ускоряющего рост животных. Для этого культуру Actinoplanes sp. NRRL 3884 предлагается выраш,ивать в аэробных условиях на среде, содержаш.ей источники углерода, азота и минеральные соли, с цоследуюш,им выделением целевого продукта в виде основания или соли из фильтрата культуральной жидкости известными приемами.

Вырашивать культуру рекомендуется при температуре 20-40°С в течение 2-10 дней.

Новый антибиотик представляет собой белое твердое аморфное веш,ество, -66,6 (, 50%-ный водный метанол). Приблизительный элементарный состав его (в %): углерод 53,06; водород 6,18; азот 5,79; кислород 31,40 и хлор 3,39. Антибиотик в виде хлористоводородной соли представляет собой белое кристаллическое твердое вещество с температурой плавления от 207 до 212°С; растворим в теплой воде и в 50%-ном водном метаноле; имеет четыре титруемых группы, две из

них имеют значения рк от 7,0 до 9,7; рк двух других более И, что было определено путем потенциометрического титрования в 66%-ном водном диметилформамиде; приблизительный

элементарный состав его (в %): углерод 55,36; водород 6,02; азот 5,73; кислород 28,99; общий хлор 4,52 и неорганический хлор 1,28; молекулярный вес примерно 1480, определяемый методом осмометрип под давлением пара; в

растворе минерального масла имеет следующие, явно различимые полосы спектра поглощения инфракрасных лучей: 3,0; 5,8; 6,02; 6,3; 6,62; 6,84; 7,02; 7,26; 7,32; 7,7; 8,1; 8,27; 8,52; 8,97; 9,35; 9,7; 9,8 и 10,1 мк; в водном растворе кислоты и в нейтральном растворе в УФ-ой области спектра имеет максимум поглощения

EICM 53 при длине волны -283 ммк; в водном растворе основания в УФ-ой области спектра

имеет максимум поглощения Eiiu 60 при длине волны 362 ммк и EICM 53 при длине волны 362 ммк.

Антибиотик может быть выделен известными способами извлечения и очистки. Он способен как обычно образовывать соли с неорганическими кислотами, такими как соляная, серная, фосфорная и другие аналогичные кислоты, а также с различными органическими кислотами, включающими уксусную, пропионовую, малоновую, янтарную, винную, малеино3

вую, пикриновую, бензойную, паратоуолсульфокислоту, никотиновую и другие.

Антибиотик в виде свободного основания представляет собой белое аморфное твердое вещество, имеющее следующий элементарный состав (в %): углерод 53,06; водород 6,18; азот 5,79; .кислород 31,40 и хлор 3,39.

-66,6 (, 50%-ный водный метанол).

Хлористоводородная соль антибиотика представляет собой белое кристаллическое твердое вещество с температурой илавления от 207 до 212°С, растворимое в теплой воде и очень быстро растворимое в 50%-ном водном метаноле. Хлористоводородная соль этого антибиотика стойка в растворе в пределах величины рН от 1 до 10 нри температурах вплоть до 27°С. Потенциометрическое титрование хлористоводородной соли антибиотика в воде выявляет присутствие одной группы с величиной рк 6,2 и присутствие пяти или более групп с величинами рк в пределах от 8 до 10,5. Потенциометрическое титрование хлористоводородной соли антибиотика в растворе диметилформамид - вода (в соотношении 2; 1) показывает присутствие двух групп с величинами рк от 7,0 до 9,7 соответственно и присутствие двух или более групп с величинами рк более И.

Определение молекулярного веса осмомегрическим методом под давлением пара показывает, что минимальный молекулярный вес хлористоводородной соли антибиотика составляет примерно 1480.

Средние показатели нескольких испытаний на элементарный анализ выявляют следующий элементарный состав хлористоводородной соли антибиотика (в %): углерод 55,36; водород 6,02; азот 5,73; кислород 28,9; общий хлор 4,52 и неорганический хлор 1,28.

На чертеже показана кривая поглощения в ИК-ой области спектра хлористоводородной соли антибиотика в минеральном масле. Наблюдаются следующие, явно различимые максимумы поглощения; 3,0; 5,8; 6,02; 6,3; 6,62; 6,84; 7,02; 7,26; 7,32; 7,7; 8,1; 8,27; 2,52; 8,97; 9,35; 9,7; 9,8; 10,1 мк.

Спектр поглощения в УФ-ой области спектра хлористоводородной солн антибиотика в кислотном н в нейтральном водном растворе имеет максимум поглощения (прн длине волны 283 ммк Е/см 70. Хлористоводородная соль антибиотика в основном растворе имеет максимумы поглощения при длинах волн 300 и 362 мкм соответственно EICM 60 и 53.

Антибиотик имеет следующие величины Rf в хроматографических системах (проявление на бумаге) при использовании в качестве детектирующего организма Bacillus subticis: 0,05 в бутаноле, насыщенном водой; 0,26 в бутаноле, насыщенном водой, с 2% п-толуолсзльфокислоты; 0,84 в растворе из 19 ч. метанола, 6 ч. ацетона и 75 ч. воды; 0,40 в растворе из 3 ч. метанола и 1 ч. 0,1 н. НС1; 0,62 в воде, насыщенной метнлизобутилкетоном с I % п-толуолсульфокислоты.

Антибиотик оказывает ингибирующее действие на некоторые микроорганизмы, замедляя их рост. Предельные значения ингибирующего действия, предотвращающего рост указанных ниже организмов, показаны в табл. 1.

Таблица 1.

Антибактериальная активность хлористоводородной соли антибиотика

Минимальная ингибирующая концентрация

(мкг/мл)

Испытываемый организм

Показатель токсичности хлористоводородной соли антибиотика, определяемый на мышах и выраженный как величина LDgo, равна 350 мг/кг нри внутрибрющном введении в организм животного.

Хлористоводородная соль антибиотика, вводимая в жнвой организм мыщей путем подкожной инъбкпии, оказывает противоинфекционное действие, причем LDgo при показанных ниже инфекциях имеют следующие значения Staphylococcus aureus 305583 мг/кг

Streptococcus pyogenes 1 мг/кг

Diplococcus pneumoniae 5,5 мг/кг

Другим очень важным свойством антибиотика является его способность замедлять рост микроорганизмов, влияющих на околозубные (периодонтальные) заболевапия. При разведении в питательном бульоне концентрация хлористоводородной соли антибиотика, равная 1,0 мкг/мл, вызывает замедление роста кариогенных организмов Odontomyces viscosus.

Раствор хлористоводородной соли антибиотика оказывает антибактериальное действие на кариогенные организмы, как показано в следующей системе испытания.

Трубки с питательным бульоном, содержащим 5% сахарозы, подвергали ннокулированию с кариогенными микроорганизмами. Каждая трубка снабжена узким стеклянным стержнем, помещенным в нее, и простирающимся под поверхностью питательного бульона. После инкубирования при температуре 37°С в течение ночи на поверхности этих стержней образовывался слой негативной колонии вируса. Затем эти стержни переносили

в раствор, содержащий хлористоводородную соль антибиотика в различных концентрациях, и эти стержни оставляли в контакте с указанным раствором в течение различных нериодов времени 5, 10 и 15 мин. По црошествин ограниченного периода времени стержни промывали стерильной деионизированной водой, н затем их инкубировали при температуре 37°С в течение 18-24 час в неинокулированной среде.

Рост организмов определяли, наблюдая изменения цвета бромтиола синего от синего до желтого, вызванного образованием кислоты организмами.

Раствор хлористоводородной соли антибиотика при концентрации 1% эффективен в отношении кариогенного организма Streptococcus sp. в случае, когда этот раствор контактировал с клетками организма в течение пяти минут. Рост другого вида Кариогенного организма Streptococcus был прекращен при воздействии 1%-ного раствора данного антибиотика, находящегося в контакте с клетками организма в течение пяти минут.

Три вида кариогенных организмов StreptoCOCCUSS были ингибированы хлористоводородной солью антибиотика при концентрации 5 мкг/мл и разведении в питательном бульоне. Другая разновидность кариогенного организма (нитевидного типа) была ингибирована хлористоводородной солью антибиотика при концентрации его 1 мкг/мл и разведении в питательном растворе.

Антибиотик способен ускорять рост животных. При добавлении хлористоводородной соли антибиотика в рацион для цыплят в количестве 45,4 г на тонну средний привес цыплят спустя десять дней составлял 154,2 г по сравнению с привесом контрольной группы кроликов, составлявшим 147 г. Эффективность превращения пищевых продуктов в организме цыплят при введении хлористоводородной соли антибиотика составляла 1,43. Эффективность превращения пищи у контрольной группы кроликов - 1,53.

Из описанных характеристик антибиотика ясно, что его можно применять для подавления роста патогенных организмов. Так например, ра-створ, содержащий указанный антибиотик соответствующей концентрации, может использоваться для дезинфекции зубоврачебных и хирургических инструментов, стеклянных изделий и т. д. Этот антибиотик может использоваться также в растворе для дезинфекции поверхностей, например стен, подов, поверхности столов и других участков, где требуется поддержание стерильных условий, например в госпиталях, при приготовлении пищи и так далее.

Ввиду активности этого антибиотика против кариогенных организмов и организмов, вызывающих околозубные заболевания, он может быть введен в определенных концентрациях в препараты, используемые для гигиены рта.

на-прнмер в зубную пасту, зубной порошок, Е

промывные жидкости, эликсиры и так далее.

Для ускорения роста животных его можно

добавлять в питательный рацион или растворять в питьевой воде.

В любом из перечисленных применений антибиотик может быть введен в организм либо в виде фармацевтической кислой соли, либо Б виде свободного основания, причем выбор

способа ввода его в организм определяется физическими характеристиками антибиотика или какими-либо другими факторами, а не биологической активностью, которая является одинаковой как для свободного основания, так

и для кислой соли этого антибиотика.

Микроорганизм, используемый для приготовления антибиотика, представляет собой разновидность Actinoplanes из семейства актиноплантановых Actinoplanaceae. Эти актпноплантановые являются типичным семейством микроорганизмов типа Актпномкпелатов. Микроскопическое изучение морфологии. Вегетативный мпделлий находится на Lisjuidamber (древесная смола) в виде пыльны в

воде. Палисадная гифа составляет в среднем 1,3X13 мк лишь с редким возможным отклонением. Спорангн образуются на пыльце и в среде International Streptomvces Project JVb 3 (Shirling; and Gottlieb). Споранги ппедставляют собой шарообразные частицы средним диаметром 7,5 мк и с неоднородной поверхностью. Споры при рассмотрении их в электронном мпкроскопе имеют шарообразную форму 1,7Х Х1,2 мк. Они подвижны, имеют много жгутиков.

Характеристика сред культивирования антибиотика в результате наблюдения после роста в течение 21 дня при температуре 30°С. Обозначение ISP относится к культивирующей

среде International Streptomyces Project Media (Sherling and Gottlieb).

Обильный рост. Среда

Дрожжевой - солосветло-коричневая (13F8). довый агар (ISP № 2) Отсутствие растворимого пигмента.

Обильный рост. ОранАгар Czapek жевая среда (10 F7). Отсутствие растворимого лнгмента.

Очень сильный рост,

Агар из овсяной МУКИ ISP № 3 среда оранжево-желтая (11В7). Отсутствие растворимого пигмента.

Неорганические

Обильный рост. Коричневато-оранжевый цвет. соли - крахмал (ISP № 4) Светло-коричневый растворимый пигмент.

Обильный рост. ОранГлицерин - аспажевая среда (10Р7). Отрагин ISP № 5 сутствие растворимого пигмента.

Глицерин - глиРост очень ограниченный. Отсутствие раствоцинримого пигмента.

Сильный рост. Сероваnettто-красновато-оранжевый (11А8). Отсутствие растворимого пигмента.

Обильный рост. Копаста - ричневато - оранжевый ка (12В9). Коричневый растворимый пигмент.

Сильный рост. Светлойсероватый желтовато-коричневый (13ВЗ). Отсутствие растворимого пигмента.

Умеренный рост. Яркий

жевого желтовато - коричневый (13Н8). Коричневый растворимый пигмент.

Обильный рост. Бледаспаный оранжево - желтый (9ЕТ). Отсутствие растворимого нигмента.

Очень ограниченный

ьция рост. Отсутствие растворимого пигмента.

Случайный рост. Бледй агар ный оранжево - желтый (12ВЗ). Светло-коричневый растворимый пигмент.

Умеренный рост. Косонаричневая среда (7R11). Растворимый пигмент, темный красновато-коричневый.

Физиология.

спустя 21 день не происСнятое молоко: ходит ни коагуляции, ни осветления.

Восстановление нитрата: позитивное.

Питательный желатин: полное разжижение спустя 21 день.

Получение меланина позитивное на железопептоновом агаре (ISP № 6) спустя 24 часа.

Требования в отношении температуры: глицерин - аспарагиновый агар. От умеренного роста до обильного в интервале температур от 26 до 37°С. Отсутствие роста при 43°С.

В табл. 2 суммированы результаты испытаний с использованием углеводородов (источников углерода), которые осуществлялись на штамме Actinoplanes sp. NRRL 3884, образуюшем антибиотик.

В этой таблице использованы следуюише символы:

-f использование

(+) : возможное использование

(-) использование под вопросом - отсутствие использования

Как было отмечено, можно осуществлять выращивание микроорганизмов Actinoplanes sp. NRRL 3884 в среде культивирования, в результате чего образуется антибиотик. В качестве среды МО/кет использоваться любая из

Таблица 2

множества известных сред культивирования; однако из экономических соображений, с точки зрения максимального выхода антибиотика

и легкости его извлечения предпочтительны лишь некоторые среды .культивирования. Так, например, декстроза является одним из наиболее предпочтительных источников углевода, и соевая мука - одним из предпочтительных

источников азота.

Питательные неорганические соли, которые вводятся в среду культивирования, могут включать обычные вьшускаемые промышленностью соли, из которых могут получаться

ноны натрия, калия, аммония, фосфата, хлорида, Сульфата, ацетата, карбоната и так далее. Кроме того, в среду культивирования могут быть введены вещества, способствующие ускорению роста, такие как барда, и дрожл евые экстракты, что приводит к успешным результатам. В среду культивирования необходимо также добавлять основные микроэлементы, способствующие росту .A.ctinoplanos sp. NRRL 3884. Такие микроэлементы обычно вподятся в виде случайных примесей или в виде других составляющих компонентов среды.

Исходная величина рН культивирования может изменяться в широких пределах. Однако до осуществления инокуляции с микроорганизмом. желательно доводить величину рН среды культивирования до значения, равного от 6,5 до 7,3, в зависимости от типа используемой среды. Конечная величина рН определяется, по крайней мере частично, по начальной величине рН среды культивирования, по буферу, присутствующему в этой среде, и по длительности времени, в течение которого происходит рост организма. Для пол}чения значительных количеств антибиотика ферментация осуществляется преимущественно при погружении в аэробные условия в крупногабаритных емкостях. Незначительные количества антибиотика получаются при ферментации во встряхиваемых колбах.

Ввиду периода задержки при получении антибиотика, связанного с инокуляцией в больших емкостях организмов в форме спор, желательно использовать вегетативный инокулум. Его приготовляют путем инокулирования небольщого объема среды культивирования с фрагментами мицелия или с организмами в форме снор, в результате чего получают свежую, активно развивающуюся культуру данного организма. Вегетативный инокулум затем переносят в большую емкость для культивирования. Среда культивирования для роста вегетативного инокулума может быть той же самой средой, что используется для более объемной ферментации, хотя могут использоваться для этой цели и другие среды культивирования.

Организм, образующий антибиотик, может быть выращен при температурах от 20 до 40°С. ОПтимальиое условие - примерно 30°С.

Как и в случаях обычных процессов культивирования, при погружении в аэробные у-словия через среду культивирования продувается стерильный воздух. Для эффективного роста организма и для получения антибиотика объем воздуха, используемого в емкости культивирования для получения антибиотика, составляет преимущественно более 0,1 объема воздуха в минуту по отнощению к объему среды культивирования.

Достижение активности антибиотика в ходе процесса ферментации можно проследить путем испытания образцов питательного бульона, подвергнутого ферментации, на их антибиотическую активность, по отнощению к известным организмам, чувствительным к действию антибиотиков. Одним из таких организмов, предназначенных для испытания на действие антибиоти ка, соответствующего данному изобретению, является организм Bacillus subtilis. Биологическое испытание может осуществляться обычным образом при использовании бумажного диска в чащке с агаровой средой.

Обычно максимальное получение антибиотика наблюдается в период в пределах от двух до шести дней при ферментации в больщих емкостях или во встряхиваемых колбах. Как правило, максимальная активность антибиотика достигается в период от 48 до 96 час.

Антибиотик может быть извлечен из среды культивирования и отделен от других веществ, которые могут в нем присутствовать, способами экстракции и адсорбции. Согласно изобретению, процессы адсорбции для извлечения антибиотика являются паибоелс предпочтительными, поскольку эти процессы не требуют использование относительно больших объемов растворителя, что требуется в случае использования процессов экстракции. В качестве адсорбента для отделения данного антибиотика от фильтруемого питательного бульона внолпе подходящим является уголь, хотя вполне возможно использовать и другие известные в технике адсорбенты. Антибиотик, фиксированный на адсорбирующем агенте, извлекается с помощью обычных процессов элюировапия. Для дальпейшей очистки антибиотика используются процессы адсорбции и элюирования с применением таких адсорбирующих материалов, как полиамидные смолы, окисел алюминия, фильтрующие гели и другие вещества. Для очнсткп антибиотика могут использоваться также ионообменные смолы. Пример 1.

Ферментация антибиотика во встряхиваемой колбе.

Приготавливают культуру Actinoplanes sp. NRRL 3884 и выдерживают ее на косом агаре, имеющем следующий состав: предварительно испеченая овсяная мука 60,0 г; дрожжи 2,5 г; К2НР04 1,0 г; исходное минеральное сырье Czapek 5,0 мл; агар 25,0 г; деиопизированная вода 1 л.

Минеральное исходное сырье Czapek имеет следующий состав:

КС1100 г

M SO4-7H2O100 г

FeS04-7H202 г

(растворен в 2 мл концентрированной соляной кислоты)

Деионизированная

вода1 л

Величину рН среды культивирования регулируют до значения 7,3, используя для этой цели раствор гидрата окиси натрия. После стерилизации в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 мин при давленин 800 г/см величина рН среды составляет 6,7.

Косой агар инокулируют, используя Actinoplanes sp. NRRL 3884, и инкубируют при температуре 30°С в течение от семи до десяти дней. Выращенный мицелий покрывают стерильной дистиллированной водой, и поверхность косого агара соскабливают, разрыхляя микроорганизмы. Ввиду того что данную культуру не подвергают споруляции, л елательно мацерировать мицелиальную пленку сплющенной остро заточенной пнокулирующей иглой для того, чтобы увеличить число потенцпальпых центров роста. Половина культуры косого агара, приготовленного таким образом, используют для инокулпрования 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав:

Глюкоза10 г

Крахмал20 г

Соевая мука20 г

г

СаСОз2 г

Водопроводная вода1,1 л

Инокулируемую вегетативную среду инкубируют в течение 72 час при температуре 30°С на вращающемся грохоте со скоростью вращения 250 об/мин.

Десять миллилитров ферментационной среды используют для инокулнроваппя 100 мл второй стадии вегетативного роста среды следующего состава (в г):

Глюкоза10

Картофельный

крахмал20

Соевая мука20

Аптолизированные

пивные дрожжп3

СаСОз4

Водопроводная вода1,1 л

11

Инок лированную среду инкубируют в течение 48 час при температуре 20°С на вращающемся грохоте (при скорости вращения 250 об/мин). Эту вегетативную среду второй стадии используют для инокулирования 30 мл получаемой стерильной среды, имеюи,ей следующий состав, содержащийся в 250-мИллилитровой колбе Эрленмейера (в %): Декстроза1,0

Крахмал2,0

Маннит1,0

Соевая мука1,5

Антолизированные

пивные дрожжи0.1

СаСОз0,2

Водопроводная

водаДо 1 л

Ино:кулированную среду, содержащуюся в колбе Эрленмейера, ферментируют -при температуре 30°С в течение от 72 до 120 час на враЩающемся грохоте, имеющем скорость вращения 250 об/мин. Конечная величина рН составляет от 7,0 до 7,5.

Емкость ферментации. Описанный процесс применяют при получении вегетативной среды второй стадии. 200 мл этой вегетативной среды используют для инокулирования 25 л получаемой стерильной среды -следующего состава (в %): Декстроза1,0

Крахмал2,0

Маннит1,0

Соевая мука1,5

Антолизированные

пивные дрожнси0,1

СаСОз0,2

Антипена0,02

Вода25 л

Величину рН этой среды регулируют, доводя ее до значения 7,3-7,4 после стерилизации в автоклаве при 120°С, давлении --800 г/см в течение 30 мин.

Получаемую инокулированную среду, содержащуюся в 45-литровой емкости ферментации, ферментируют при 30°С в течение пяти дней. В ходе ферментации осуществляют аэрирование стерильным воздухом, проходящим со скоростью половины объема воздуха па один объем среды культивирования в минуту. В ходе ферментации осуществляют перемещивание обычной мещалкой со скоростью вращения мещалки 500 об/мин. Извлечение антибиотика. Все питательные бульоны ферментации, полученные в двадцатипятилитровых ем костях, выращенные в соответствии с описанным выще способом, соединяют и к ним добавляют 5 н. раствор гидрата окиси натрия с целью доведения величины рН до 10,5. Весь объем питательного раствора затем фильтруют, используя для этой цели фильтр, и мицеллярную фильтропрессную лепешку, суспензируют в воде и пепемеитивают в течение одного часа. Мицелий фильтруют и мицелярную фильтропрссспую лепешку удаляют. Фильтраты объе12

диняют, в результате чего достигают общий выход объемом 66,5 л. Величину рН объединенных фильтратов регулируют, доводя ее до значения 8,0 путем использования 3 н. раствора соляной кислоты. Объединенные фильтраты пропускают через колонну, наполненную гранулированным углем в воде. Эту колонну промывают 15 л воды и удаляют выходящие из нее потоки. Затем эту колонну промывают

20 л водного раствора соляной кислоты, имеющего величину рН 2,5 и выходящий из нее поток также удаляют. Наполненную углем колонну элюируют 4 л раствора ацетон - вода (1:1), величину рН которого доводят до 2,0

путем добавления 3 н. раствора соляной кислоты. Величину рН элюата доводят до значения 7,5-8,0 путем добавления 5 н. раствора гидрата окнси натрия. Этот элюат, содержащий антибиотик, выпаривают до объема

1700 мл. Выпаренный элюат адсорбируют в колонне размером 7X60 см, содержащей промытую водой полиамидную смолу. ЭТУ колонну, наполненную полиамидной смолой, алюирЗют восемью литрами воды, и элюат собирают в виде множества фракций. Этн фракции, содержащие антибиотик, объединяют и элюируют до получения небольшого объема. К выпаренному концентрату добавляют четырехкратный объем метанола, а затем добавляют

равный объем эфира с целью осаждения антибиотика. Этот антибиотик фильтруют и высушивают. Выход его достигает 1,1г.

Дополнительное количество этого антибиотика извлекают путем элюирования содержащей полиамид колонны раствором метанол - вода (I : 1). Элюатьт, содержащие антибиотик, объединяют и выпаривают до получения небольщого . К выпаренному концентрату добавляют четырехкратный объем метанола, и

этот антибиотик осаждается путем добавления равного объема эфира. Полученный осадок извлекают путем фильтрации. Выход продукта составляет 3 г. Пример 2. Очистка антибиотика путем

использования окисла алюминия.

Для извлечения антибиотика осуществляют ту же процедуру, что описана в примере 1 пои элюнровании колонны, наполненной углем. Величину рП алюата доводят до 7,5-8,0 путем

добавления 5 н. раствора гидрата окиси натрия, а затем его выпаривают до объема 200 мл.

100 мл этого концентрированного элюата, содерл ащего антибиотик, подают в колонну

размером 2,7X8.0 см с промытым в воде окислом алюминия. Затем эту колонну промывают двумя литрами метанола. Выходящий поток метанола удаляют. Антибиотик элюируют из колонны водным раствором метанола (1:1),

активные фракции элюата объединяют и выпаривают досуха. Высущенный осадок растворяют в 100 мл водного раствора метанола (1 : 1). Полученный в результате этого раствор добавляют к двум литрам ацетона с той

целью, чтобы вызвать осаждение очищенного

13

антибиотика. Выход продукта составляет 2,2 г. Пример 3.

Получение хлористоводородной соли антибиотика.

500 мл антибиотика, иолученного согласно описанному выше примеру, растворяют в 20 мл 50%-ного водного раствора метанола. Величину рН этого раствора доводят до 1,5 путем добавления 1 н. соляной кислоты. Полученный в результате раствор добавляют при перемешивании к 400 мл ацетона, в результате чего происходит осаждение хлористоводородной соли антибиотика. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают.

Выход хлористоводородной соли антибиотика составляет 420 мг. Пример 4.

Получение пикрата антибиотика.

К раствору 500 мг антибиотика в 20 мл воды добавляют 20 мл насышенного водного раствора пикриновой кислоты. Эту смесь выдерживают в течение ночи нри 5°С. Образующийся желтый осадок фильтруют, и получают 505 мг желтого пикрата антибиотика. Пример 5.

Получение хлористоводородной соли антибиотика из пикрата антибиотика.

К раствору 505 мг пикрата антибиотика в 25 мл метанола добавляют 1 н. раствор соляной кислоты до тех пор пока величина рН не достигает значения 1,5. Полученный кислотный раствор добавляют при одновременном перемешивании к 500 мл диэтилового эфира, в результате чего получают осадок хлористоводородной соли антибиотика. Полученный таким образом осадок фильтруют и высушивают. Получают 442 мг хлористоводородной соли антибиотика. Пример 6.

Получение свободного основания антибиотика из хлористоводородной соли антибиотика.

Раствор 500 мг хлори.стоводородной соли антибиотика в 20 мл воды пропускают над ионообменной смолой (ОП), содержаш ейся в стеклянной колонне 1X10 см. Выходяш,ий из колонны поток собирают, и колонну элюируют водой. Водный элюат и исходные выходяш,ие из колонны потоки объединяют и выпаривают в вакууме досуха. Полученный осадок раство14

ряют в 20 мл 50%-ного водного метанола и добавляют к 400 мл ацетона при одновременном перемешивании, в результате происходит осаждение свободного основания антибиотика. Осадок фильтруют и высушивают. Получают 255 мг антибиотика. Пример 7.

11олучение сульфата антибиотика.

Раствор 500 мг хлористоводородной соли

антибиотика в 20 мл воды пропускают через колонну размером 1X10 см, содержаш,ую ионообменную смолу в гидроксилцикле. Эту колону промывают водой, и активные фракции объединяют и выпаривают досуха.

Высушенный осадок растворяют в 20 мл 50%-ного водного раствора метанола. Величину рП раствора регулируют, доводя ее до 1,5 путем добавления 1 н. раствора серной кислоты, и подкисленный раствор добавляют к

400 мл ацетона. Образуется осадок сульфата антибиотика, который извлекают путем фильтрации. Выход этого продукта составляет 331 мг. Пример 8.

Получение метилоранжевой соли антибиотика.

К раствору 500 мг антибиотика в 20 мл воды добавляют 20 мл насыш,енного раствора метилоранжа в воде. Полученный раствор выдерживают в течение ночи до тех пор, пока не произойдет выпадение полного осадка метилоранжевой соли. Метилоранжевую соль антибиотика отфильтровывают и высушивают. Выход продукта составляет 521 г.

Предмет изобретения

1.Способ получения антибиотика, отличаЮШ.ИЙСЯ тем, что культуру Actinoplanes sp.

NRRL 3884 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли из фильтрата культуральной жидкости известными приемами.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют при температуре 20-40°С в течение 2-10 дней. 5000 iOOU JOOLi 2500 liJ-iO i-rlJO ijOO 20U auu WO ООО ИЗ liOlJ 850 dUO 750 WO 650