Способ получения полиэфирного антибиотика А 80190 Советский патент 1989 года по МПК C12P1/02 C12P1/06 

Характерные особенности A80I90. Антибиотику А80190 приписывают структуру I, основанную на рентгено-кристаллографических исследованиях.

А80190 в его свободной кислотной форме) имеет следующие характершде особенности.

Состояние: белые кристаллы (из ацетона - воды). Т.пл. 98 - 100 или 120 - (более часто); вероятно изменяется со степенью сольватации, рКа «6,2 (66%-ный водный диметил(Ч рмам щ) . 1

15

(с- 1, CHClj).

Мол.масса 828 (масс-спектрометрия с десорбированнын полем). УФ: поглощение отсутствует. ИК: (CHClj). Показы- Бает поглощение при следующих частотах, см- : 3019, 2970, 2936, 2827, 1721, 1457, 1402, 1376, 1314, 1163, 1105, 1092, 1083, 1056, 1022, 1006, 989, 980, 945, 934, 917, 892 и 859.

Вычислено, %: С 63,77; Н 9,18; О 27,05.

С НтбОи

Найдено, %: С 63,35; Н 9,17; О 27,10.

Растворимость. Нерастворим в воде растворим в низших спиртах, таких ка метанол, кетонах, таких как ацетон, сложных эфирах, таких как этилацетат

галоцдированных углеводородах, таких как хлороформ и углеводородах, таких как диэтиленовый эфир, бензол, толуол и теплый гексан.

А80190 имеет кислотную функцию, способную образовывать соли и сложно- эфирные производные, и имеет по крайней мере одну гидроксильную группу, которая может быть этериАнцирована или может образовывать эфирные производные или уретановые производные. Ациловый и алкиловый сложные эфиры и апкиловые эфирные производные А801.90, уретановые производные, фармацевтически приемлемые соли А80190 и этих производных также являются полезными в качестве антибиотиков, коксидиос- татков и в качестве средств, которые увеличивают эффективность использования кормов животньми.

Согласно цели изобретения в описании предлагается соединение (Ьорму- лы (I):

Изобретение относится к новому полиэфирному антибиотику А 80190 и некоторым производным его, к его получению культивированием новых штаммов микроорганизмов. Антибиотик А 80190 получают путем культивирования штамма микроорганизма ACTUNOMADURA OLIGOSPORUS 15877 или штамма микроорганизма ACTUNOMADURADIGOSPORUS 15878 на питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в условиях глубинной аэробной ферментации при 30 - 32°С. 5 табл.

Me

Me

J- /- К о оЛ-{soV

в которой R представляет водород или

- CONHR

R.

алкил, арил, алкип-арил, арилалкил, галоидарил, нитроарил, галоидарилал- кил, алкоксиарил, арилок сиарил, арипциклоалкип, аципарил и циклоалкип, или ацип, алкип сложно- эфирные или алкил-эфирны производные, или его соли.

А80190 и его производные являются полезньми в качестве антибактериальных и антипротозойных средств. Они улучшают эффективность использования кормов жвачными животньми и действуют в качестве средства, способствующего росту животных с одной желудочной полостью. Кроме того, они имеют 1шсектицидную, гербицидную и противовирусную активность. Кроме того, они являются полезными в качестве ионо- форов.

Me

Me

/- К оЛ-{soV

Термин ациловый означает от С , С, предпочтительно от С до С, алкановый кислотный остаток, т.е. ра ч

дикалы формулы

до

R

ta

- С -

II О

в которой R, представляет от С, до

С.- мил,

т.п.

алкил или водород, например фор- ацетил, пропионил, бутирил и

Термин циклоалкил означает циклические углеводородные группы, содержащие 3-7 углеродных атома, такие как циклопропил, циклобутил, цикло- гексил и другие, причем циклогексип является предпочтительные. Циклоал- кильная группа может быть замещенной арильным остатком, например 2-(фе- нил)-циклопропилом.

Термин алкокси означает низшую от С, до С алкильную группу, имеющую замещенную кислородную Функции в ней.

такум как метокси, этокси, пропокси и т.п.

Термин арил означает ароматичес кий остаток, полученный удалением атома водорода из ароматического углеводорода, такой как, например, Ае- нил, пиридип или фурил, особенно фенил. Арильный остаток может быть замещенным различньии группами. Заместитель на фенильном ядре расположен предпочтительно в положении 4. Примерами являются А-алкиларил, например 4-метилфенил (4-толип); 4-галонцфе- нил, например А-хлорфенил; 4-нитрофе нил; 4-арилоксиарил, например 4-фе- ноксифенил; 4-алкоксифенил, например 4-метоксифенил; 4-(алкилкарбонил)-фенил, например 4-(метилкарбонил)-фени или 4-(фенилкарбонил)-фенил.

Термин аЛкил означает С, -С, углеводород с линейной или разветвленной цепью, предпочтительно С,-С углеводород, например метил, этил, пропил, изопропил, и-бутил и т.д. Ал- кильная группа может быть замещенной арильным остатком, как это определено выше, чтобы образовать арилалкильный остаток, например фенилэтил или 2-фе- нилэтил, или галондарильным остатком чтобы образовать галоидарилалкильный остаток, например 4-бромфенэтил.

Соли A80I90 и его производных являются полезными для разделения и очистки антибиотиков. Особенно полезными являются фармацевтически приемлемые соли. Такие соли должны иметь малую или вовсе отсутствующую токсичность по отношению к теплокровным животным. Примерами солей являются соли A8G190 и его производных щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аминов.

Соли А80190 щелочных металлов и щелочно-земельных металлов включают соли натрия, калия, лития, цезия, рубнция, бария, кальция и магния. Аминовые соли А80190 включают соли аммония и первичного, вторичного и третичного С,-С алкиламмония и окси- алкипаммония . Аминные соли включают соли, образующиеся по реакции А80190 с гидроокисью аммония, метиламином, вторбутиламином, изопро- пиламином, диэтиламином, диизопропил- амииом, этаноламином, триэтиламином, З-амино-1-пропанолом и т.п.

Широко известно в ветеринарной фармацевтической области, что форма

0

0

5

5

0

5

0

5

0

5

антибиотика обычно не является существенно важной при лечении животного антибиотиком. В большинстве случаев состояние животного изменяет форму лекарства, отличающуюся от формы, которая была введена. Солевая форма, в которой оно могло быть введено, не является, следова- тельно, существенно важной. Однако солевая форма может быГь выбрана по причинам экономии, удобства и отсутствия .токсичности.

Антибиотик А80190 может быть получен культивированием А80190 - проду- цирующего штамма Actinomadura oligos- pora при глубинных аэробных условиях в подходящей питательной среде до тех пор, пока не будет достигнута значительная антибиотическая активность. Антибиотик выделяют путем использования .разнообразных методик выделения и очистки, известньк в данной области техники.

Новый Actinomadura oligospora - микроорганизм данного изобретения, который продуцирует антибиотик A80I90, выделен из образца почвы из Индии. Впоследствии значительно улучщенный вариант, который продуцирует повышенные количества А80190, был выделен Ла-Верне Д.Доек ом. Культуры этих двух А80190 - продуцирующих организмов сданы на хранение и стали частью коллекции культуры родов в Северном Региональном Исследовательском 1 ентре (Сельскохозяйственные исследования), из которой они доступны публике под инвентарными номерами NRRL 15877 (родительский штамм) и NRRL 15878 (штамм измененной особи - вариантный штамм). Согласно таксономическим исследова- ниям два Новых микроорганизма классифицируют как члены нового вида рода Actinomadura, для которого предлагается название Actinomadura oligos- pora.

Характеристики культур. Культивирование организма обычно слабое на . химически определенной среде, но более хорошее на комплексной органической среде. Воздушные мииелии отсутствуют, за исключением следовых количеств на IPS М 4 и натрий-бутират- ном агаре. Если присутствуют споры, то их окраска устрично-белая по системе Треснера и Баккуса. Пвет обратной стороны от желтовато-зеленого до коричневого. Не прюдуцируются раствоимые пигменты, за исключением проуцирования очень светло-коричневого астворимого пигмента в случае ISP 2 агара и темно-коричневого раство- j римого пигмента в декстрозо-дрожже- ом агаре. В табл. 1.представлена характеристика культур NRRL 15878 и .тасга на различных агаровых среах.10

Морфологические характеристики. Цепи спор продуцируют разбросанно на ISP 4 и йатрий-бутиратном агаре. Спорофоры, содержащие приблизительно 15 10 спор на цепь, в основном извилистые в виде вправо изгибающейся (R - И) конфигурации. Однако наблюдаются также крючковатые спорофоры. Воздушные гифы (нити грибниЩ) ) имеют тен- 20 денцию группироваться вместе. Форма спор продолговатая и изменяется по размеру от 0,5 - 0,7 до 0,9 - t,. Усредненный размер спор составляет 1,1 - 0,. Рисунок поверхности 5

спор гладкий.

В табл. 2 приведена картина использования углевода штаммом NRRL 15878 по сравнению с А.масга. ISP , (рреду № 9 используют в качестве ос- новной). Добавление витамина В или использование среды Луйдемана способствует более хорошему культивированию, но не изменяет использование углерода. Использованы адонит, целлобиоза, s глюкоза и рибоза. Сомнительное использование отмечают в случае фруктозы и ксилозы. Арабиноза, целлюлоза, декстран, галактоза, цис-инозит, инулин, лактоза, маннит, манноза, мели- 40 зитоза, мелибиоза, раффиноза, рамно- за, салицин, сахароза, трегалоза и ксилит не используются для культивирования,.

В табл. 3 приведены данные об ус- 45 тойчивости штамма NRRL 15878 к разнообразным антибиотикам при указанных концентрациях и сравнение их с А.масга.

50

NRRL 15878 культивируют при температурах при концентрации до 2% NaCl. Он продуцирует каталазу, фосфатазу и уреазу.

NRRL 15878 деградирует казеин, . 55 ДНК, эскулин и желатину, но не разлагает аденин, кальциевую соль яблочной кислоты, хитин, эластин, гуанин, гип- пурат, гипоксантин, кератин, крахмал,

тестостерон, крахмал, тирозин или ко- антин.

Анализ клеточной оболочки. Гидро- лизованные цельные клетки содержат мезоизомер диаминопимелиновой кислоты. Сахары, присутствующие в гвдроли- затах цельных клеток, следующие: глюкоза, манноза, мадуроза и рибоза. Типом клеточной оболочки согласно Бэк- керу является шип III, а образец сахара является типом В. Качественный анализ метанолизатов цельных клеток на миколевые кислоты дает сомнительные результаты. Сомнительно, что культура содержит миколевые кислоты. Был обнаружен тип Р1 фосфолипидного образца. Тип Р1 не содержит азотных фосфолипидов и является характерным для рода Actinomadura.

Подлинность штамма. NRRL 15878 имеет клеточную оболочку типа Ш. Тип В цельной клетки сахарного образца и Тип Р1 фосфолипкцного образца. Эта хомотаксономическая информация вместе с общими характеристиками культур согласуется с отнесением штамма к роду Actinomadura по Лешевалье. Сравнение его характеристик с таковыми в опубликованных описаниях известных видов Actinomadura показьшает, что культура подобна A.pelletieri.

Культура напоминает Actinomadura pelletieri главным образом по отсут-. ствию 1ли по крайней мере редкому уа- личию воздушных мицелий. Морфология спорофоров, когда они продуцируются, подобна описанной в литературу Рз. Две культуры также обладают рядом физиологических характеристик. Однако культуральные и физиологические различия являются достаточными, чтобы отделить их в качестве отдельного вида А.pelletieri вызывает деградацию эластина, гип оксантина, кератина ги- розина, использует трегалозу, восстанавливает (редуцирует) нитрат и культивируют при 45 С, однако NRRL 15878 не имеет этих характеристик. Последний использует адонит и целлобиозу, вызывает деградации эскулина и ДНК и является устойчивым к лизоциму, однако А.pelletieri не имеет этих характеристик. Следовательно, новая культура является видом, отличным от А.pelletieri.

Из-за подобности культуры А.масга осуществляют одновременные лабораторные исследования NRRL 15878 и А.маега, которые обладают многими общими свойствами. Оба не способны вызьшать деградаияю аденина, кальциевой соли яблочной кислоты, хитина, эластина, гуанина, кератина, крахмала, тестостерона, тирозина и ксантина. Ни тот, ни другой не продуцирует или мел- аноидные пигменты. Обе культуры вызывают деградацию казеина, ДНК и желатины, продуцируют каталазу и фосфата- зу, а также синтезируют полиэфирный антибиотик. Они имеют одинаковую толерантность к NaCl, оба культивируютизвестными физическими и химическими мутагенами, такими как ультрафиолетовый свет, рентгеновское излучение, гамма-излучение и химикалии, такие как Ы-метил-Ы -нитpo-N-нитpoзoгyaни- дин. Природные и индуцированные варианты, мутанты и рекомбинанты Acti- noraadura oligospara NRRL 15877, которые сохраняют характеристику A80I90 продуцирования, рассматриваются частью данного изобретения.

Среда для выраг;ивания, используемая для культивирования культур Acti10

ся на бутирате натрия, они имеют оди- oligospora, может быть любой

наковый тип клеточной оболочки.из ряда сред. Для экономиии при про- ,

А.масга и NRRL 15878 разливаютсядуцировании, получения

по картине использования углерода, повыхода и легкости выделения продукта

деградации эскулина и поксантина, ус-некоторые среды для выращивания являтойчивости к антибиотикам, температур-20ются предпочтительными. Так, напри

ному пределу, продуцированию уреазы и редуцированию нитрата.

А.масга и NRRL 15878 обладают многими общими культуральными характе- ристиками, особенно отсутствием воздушных мицелей. Однако имеются и значительные различия. Обратная сторона NRRL 15878 от зеленой до желтовато- коричневой окраски, А.масга на многих средах окрашивается в красный цвет. Это отличие наиболее четко проявляется на глкжозо-аспарагиновом агаре. На этой среде А.масга в отличие от jNRRL 15878 продуцирует розовое воздушное разрастание. Эти культуральные сравнения показаны в табл. 1 .

Морфология NRRL I5878 подобная таковой А.масга. Обе имеют плохо развитые воздушные мицелии. Поверхности спор гладкие. Различия и сходства между NRRL 15878 и А.масга изложены в табл. А.

В табл. 5 показаны подробные сходства и различия NRRL 15878 и А.масга.

Эти сравнения показьгаают, что NRRL 15877 и NRRL 15878 культуры значительно разли 1аются от других видов Actinomadura и представляют штаммы нового вида, для которых предлагается название Actinornadura oligospora - новый вид. Штамм NRRL 15878 является типовым штаммом A.oligospora. Как и в случае с другими организмами характеристики А80190, продуцирующей культуры данного изобретения, Actinomadu- га oligospora NRRL 15878 подвергаются изменению. Рекомбинанты, мутанты или варианты штамма могут быть полу чены путем обработки разнообразными

известными физическими и химическими мутагенами, такими как ультрафиолетовый свет, рентгеновское излучение, гамма-излучение и химикалии, такие как Ы-метил-Ы -нитpo-N-нитpoзoгyaни- дин. Природные и индуцированные варианты, мутанты и рекомбинанты Acti- noraadura oligospara NRRL 15877, которые сохраняют характеристику A80I90 продуцирования, рассматриваются частью данного изобретения.

Среда для выраг;ивания, используемая для культивирования культур Acti

0

5

е

мер, Т1редпочтительным углеводным источником при крупномасштабном фер- ментировании (брожении ) является глюкоза, хотя могут быть использованы . 5 также рибоза, ксилоза, фруктоза, галактоза, манноза, маннит, картофельный декстрин и т.п. Глицерин и ли- пиды поддерживают незначительно или вовсе не поддерживают культивирование или продуцирование антибиотика, когда используются в качестве главного источника углерода. В сочетании с глюкозой они увеличивают биомассу, но уменьшают продуцирование антибиотика.

Предпочтительным источником азота является гидролизат коллагена, хотя полезными являются также эизин - гид- ролизованный казеин, пептоны из мяса, рыбная мука, мука из печени и т.п. Среди питательных неорганических солей, которые могут быть внесены в среду для выращивания, обычными являются растворимые соли, способные давать цинковые, натриевые, магниевые, кальциевые, аммонийные,- хлоридные, карбонатные, сульфатные, нитратные и подобные ионы.

Ценные следовые количества элементов, необходимые для роста и развития организма, также должны быть включены в среду для выращивания. Такие следовые количества элементов обычно встречаются в виде примесей в других заменителях среды в количествах, достаточных для удовлетворения культивируемых требований организма. Пенс- образование обычно не является проблемой, но малые количества (.т.е.

0

5

0

11

153

0,2 мл/л) антивспенивающего агента, такого как полипропиленгликоль, могут быть добавлены в крупномасштабнукГ , ферментационную бродильную среду, если это необходимо.

Для продуцирования значительных количеств антибиотика А80190 глубинная аэробная ферментация является предпочтител1 ной.

Пример 1. Получение А80190. А. Ферментация А80190 во встряхиваемой колбе. Культуру Actinomadura oligospora NRRL 15878 в ввде лиофи- лизированной пилюли либо в вцце суспензии, содержащейся в жвдком азоте, используют для посева на среду следующего состава, мас.%; глюкоза 1,0; растворимый крахмал 2,0; дрожжевой экстракт 0,5; энзиматический гидроли- зат казеина (NZ амин А, Шеффилд Ке- микал Ко, Норвич, Нью-Йорк) 5,0; СаСО 0,1. Деионизированкая вода (количество раствора) 1 л. NaOH добавляют, чтобы повысить рН среды примерно до 7,2 до стерилизации.

Наклонные плоскости и пластины готовят добавлением 2,5% агара к посевной среде. Микроорганизмы на наклонной плоскости инкубируют при в течение примерно 10-14 дней. Созревшую на наклонной плоскости культуру соскабливают с помощью стерильного инструмента. Около одной четверти освобожденных спор и выращенной культуры, полученных таким образом, используют для засева 50 мл посевной среды первой стадии.

Привитую среду первой стадии инкубируют в колбе Эрлеймейера емкостью 250 мл при в течение 48 ч на встряхивателе с круговой орбитой в два дюйма (5,08 см) при скорости 250 об/мин. Эту среду (0,4 мл) используют для посева 50 мл продуцируемой среды, имеющей следукяций состав, %: глюкоза 3,0; NZ амин А 0,4; гидро- лизат коллагена 0,5; Н 0,05; CaCOj 0,2. Холодная водопроводная вода (количество раствора) 1 л. Предварительную стерилизацию осуществляют доведением рН до 7,0

Продуцирующую среду инкубируют в широкогорлой колбе Эрлеймейера емкостью 250 мл при 30 - в течение 8-10 дней на встряхивателе с круговой орбитой в 5,08 см со скоростью 250 об/мин.

1 2

R. Ферментация А80190 в большом объеме. Для обеспечения больщего объема посевного материала использу- ют 10 мл инкубированной среды первой стадии, полученной как это описано в разделе А, для прививки 400 мл питательной среды второй стадии, имеющей состав, одинаковый со средой первой стадии. Эту вегетационную среду.второй стадии инкубируют в щирокогорлой колбе Эрлеймейера емкостью 2 л в течение 48 ч при ЗО С на встряхивателе с круговой орбитой в 5,08 дм со ско- ростью 250 об/мин.

Полученную таким образом вегетационную среду второй стадии (800 мл) используют для прививки 100 л стерильной продуцирующей среды, получен- ной как описано в разделе А. Продуцирующую среду подвергают Ферментации в 165-литровой перемешиваемой Фермен- ационной цистерне в течение 8- 10 дней при температуре 30 - 32°С. Спабый поток воздуха (0;12-0,25 об/об м/мин) и низкая скорость перемешивания (150 - 200 об/мин) в перемешиваемом сосуде поддерживают уровень растворенного кислорода вьпое 30% насыце- ния воздухом.

Пример 2. Отделение А80190. Весь ферментационный бульон из двух 100-литровых цистерн объединяют (207 л) и фильтруют через фипьтр- пресс с помощью Hyflo Supercel, Мице- Лиальную спекщуюся массу на фильтре экстрагируют циркулирующим метанолом (40 л) через фильтр-пресс. Ацетон также может быть использован в каче- стве экстрагирующего вещества. Ке- танольный экстракт, концентрированный под вакууммом до объема примерно . 15 л, объединяют с бульонным фильтра- том (182 л). Смесь доводят до рН 9 с помощью 1 н. гвдроокиси натрия, полученный раствор экстрагируют равньм объемом этилацетата. Этнпацетатный экстракт концентрируют до объема при мерно 700 мл. К концентрированному экстракту добавляют 1 л воды, рН доводят до 9,0 с помощью гидроокиси натрия, смесь экстрагируют дважды толуолом (1 л), поддерживая рН при 9,0. Толуольные экстракты объединяют и концентрируют под вакуумом, получая маслянистый остаток, содержащий А80190.

Остаток растворяют в толуоле (100 мл) и вносят в колонку, содержащую 2 л силикагеля (фирма Woelm, 70 150 меш) в толуоле. Колонку элюируют сначала толуолом (10 л), а затем смесью толуол:этанол (49:1, 10 л) и (48:2, 10 л), собирая фракции по 1 л Элюирование контролируют биоаналиэом и тех. Фракции, содержащие А80190, объединяют и концентрируют. Остаток растворяют в диоксане и высугаивают замораживанием, получая 13,6 г сьфо- го А80190.

Пример 3. Очистка А80190.

Сырой А80190{20,4 г )., полученный из четырех цистерн объемом 100 л аналогично примерам 1 и 2, рйстворяют в ацетонитриле (200 мл). Раствор вводя в колонку, содержащую 2 л силикагеля (фирма toelm, 70 - 150 меш) и ацето- нитрила. Колонку промьшают аиетонит- рилом (10 л) и элюируют последова- . тельно смесями ацетонитрнпацетона (9:5, 2 л),(9:1, 1 О л),(4:1, 10 л) и (7:3, 10 л), собирая фракции по 1 л. Элюирование контролируют биоанализом используя Bacillus subtilis. Фракции, содержащие А80190, объединяют и концентрируют. Остаток растворяют в диоксане и высушивают замораживанием, получая 15,8 г очищенного А80190.

Пример 4. Кристаллизация А80190.

Очищенный А80190 (28,2 г) растворяют в ацетоне (500 мл). Добавляют воду (500 мл) и рН доводят до 5,0 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Полученный раствор оставляют при комнатной температуре в течение 20 ч для кристаллизации. Кристаллы отделяют фильтрованием,промывают водой и высушивают в вакуумной печи, получая 25,9 г кристалли 1еского А80190 (кислотная форма).

Пример 5. Получение А80190 натриевой соли.

А80190 (кислотная форма, 300 мг) растворяют в ацетоне (30 мл), добавляют воду (10 мл) и рН доводят до 10 с помощью NaOH. Раствор концентрируют до маслянистого остатка, который растворяют в диоксане и высушивают замораживанием, получая белый порошок (т.пл. 145 - 150). Мол. масса продукта по масс-спектрометрии с полевой десорбцией (ИСПД) составляет 850, Ж в СНС1з показьшает максимумы полос поглощения при следующих частотах, см- : 2962, 2934, 2885, 2825, 1719, 1569, 1455, J397, 1377, 1358.

1314,1285, 1243, 1162, 1104, 1074, 1057, 1025, 897, 979, 936, 922, 895 и 847.

, Пример 6. Другой способ по-, лучения натриевой соли А80190.

А80190 (кислотная форма, 5 г) растворяют в этилацетате (500 мг), добавляют воду (500 мл). Смесь доводят

Q до рН 10с помощью 5 NaOH, перемешивая в течение 15 мин, что&ы поддерживать рП. Этилацетатную фазу отделяют, промьюают водой (500 мл) и концентрируют под вакуумом досуха. Остаток

5 растворяют в диоксане (100 мл) и высушивают замораживанием, получая 4,1 г натриевой соли А80190.

Водные промьтки оставляют при комнатной температуре на ночь,а образую0 щиеся кристаллы фильтруют и высушивают. Кристаллы являются А80190 в кислотной форме (т.пл. 115 - 120 С).

Пример 7. Кристаллизация натриевой соли А80190.

5 Патриевую соль А80190 (1 г) растворяют в пентане (10 мл) и оставляют стоять при комнатной температуре в течение трех дней (растворитель выпаривают до объема смеси примерно 5 мл).

0 Образующиеся кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, получая 593 мг кристаллической натриевой соли А80190, т.пл. 225 - 230°С.

Пример 8. Получение ацети- лированного А80190.

A80I90 (кислотная форма, 200 мг) растворяют в пиридине (4 мл), добавляют уксусный ангидрцц (4 мл) и смесь оставляют стоять в течение 72 ч при

Q комнатной температуре. Добавляют во-. ду (10 мл), водный раствор экстрагируют хлороформом (50 мл). Хлороформный экстракт промьшают последовательно по 50 мл каждая 0,1 н. раствором

5 НС1, водой, содержащей 1Z NaHCO, и водой. Затем хлороформный экстракт концентрируют под вакуумом до получения остатка, который растворяют в ацетоне (100 мл). Ацетоновый раствор

0 концентрируют под вакуумом, чтобы удалить остаточный пирнпин и уксусную кислоту. Эту стадию повторяют трижды, а полученный остаток- растворяют в ацетоне (50 мл). Добавляют воду (50 мл) и полученный раствор оставляют стоять при комнатной температуре до завершения кристаллизации. Кристаллы отделяют сЬильтрсванием, промывают водой и сушат в вакуумной

5

5

15

печи при 50 С, получая 192 мг крис- - таллического ацетилированного А80 , 90 (т.пл. 87 - ). Мол. масса равна 870 по масс-спектрометрии с быстрой атомной бомбардировкой (МСБАБ), ИК в ClIClj показывает максимумы полос поглощения при следующих частотах, 3021, 3018, 2935, 2825, 1726, 1454, 1373,1311, 1244, 1162, 1104, 1078, 1058, 1025, 867, 976, 934 и 925.

Пример 9. Получение пропио- нил-производного А80190.

А80190 (кислотная форма, 200 мг) растворяют в пиридине (4 мл), добавляют пропионовый ангидрид (4 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 72 ч. Добавляют воду (10 мл) и раствор экстрагируют хлороформом (50 мл). Хлороформный экстракт промывают последовательно по 50 мл каждая 0,1 н. раствором НС1, - водой, содержащей 1% NaHCG, и водой. |Хлороформный экстракт концентрируют под вакуумом, чтобы получить остаток, который растворяют в ацетоне (100 мд) Ацетоновый раствор концентрируют под вакуумом, чтобы удалить остаточные пиридин и уксусную кислоту. Эту ста- дию повторяют трижды. Остаток раство- в ацетоне (50 мл) , добавляют воду (50 мл) и смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение 16 - 20 ч до завершения кристаллизации. Кристаллы отделяют фильтрованием, промьшают водой и высушивают в вакуумной печи при 50°С, получая 170 мг кристаллического пропионил- производного А80190 (т.пл. 83 - 8) Мол. масса равна 884 по МСПД и МСБАБ, ИК в CHClj показьшает максимум полос поглощения при следующих частотах, см- : 3018, 2976, 2935, 2827, 1725, 1460, 1376, 1313, 1160, 1105,1082, 1058,1024, 987, 979, 945, 935 и 893. Дримеры 10-12. Следующие сложно-эфирные производные А80190 могут быть получены по методике примеров 8 и 9: н-гептаноильное производное А80190, валерил-производное А80190, трет-бутирил-производное А80190.

Пример 13. Получение 4-бром- фенипуретан-производного А80190.

А801 90 (кислотная dbopMa, 7 г) растворяют в. бензоле (100 мл) и при перемешивании добавляют 4-бромфенилизоиианат (3 г) в бензоле (100 мл). - Смесь перемешивают при комнатной тем3I861

. . . ,

10

15

20

25

16

пературе в течение 168 ч. Реакцию контролируют ежедневно ТСХ на силика- геле, используя ацетонитрил: ацетон (1:1) в качестве проявляющего растворителя, и детектируют с помощью рас- пыпительного вещества - смесь ванилина и ,. Реакция завершается за 168 ч. Образующийся осадок отделяют фильтрованием, а фильтрат, содержащий производное и некоторое количество непрореагировавшего A80I90, концентрируют и лиофилизируют, получая 7,5 г продукта реакции.

Этот продукт растворяют в ацето- нитриле (50 мл) и вводят в колонку, содержащую 800 мл силикагеля (фирма Vfoelm, 70-150 меш) в ацетонятриле. Колонку проявляют ацетонитрилом, со- ,бирая первую фракцию, имеющую объем 500 мл, пять последующих фракций по 100 мл каждая, а затем щесть фракций по 500 мл каждая. Элюирование контролируют с помощью ТСХ на силикагеле. Кристаллы образуются в четвертой фракции после стояния при комнатной температуре в течение ночи. Кристаллы отделяют фильтрованием и высушивают под вакуумом, получая 639 мг 4-бромфенилуретан-производного A80I90.

Фильтрат высушивают. Остаток растворяют в диоксане ( и лиофи- лизируют, получая дополнительное количество продукта (477 мг). Пятую по десятую фракции объединяют и концентрируют досуха. Остаток растворяют в ацетонитриле (50 мл) и лиофилизируют, получая дополнительно 2,3 г аморфного 4-бромфенилуретан-производного А80190. Это соединение имеет следующие характеристики: т.пл. 142 - 145°С, о(У +4 С (с 10, CHClj). Мол. масса 1025 (УСБАБ).

Примеры 14-15. Следующие уретановые производные А80190 получают, используя методику примера 13: 4-хлорфенилуретан-производное А80190 и 4-нитрофенипуретан-производное А80190.

Примеры 16-23. Следующие уретановые производные могут быть получены, используя методику примера 13: фенилуретан-производное 180190; 4-ме- 55 тш1фенш1уретан-производное А80190; 4-йодфенилуретан-производное A80J90; 4-фторфенилуретан-производное А80190; циклогекснпуретан-производное А80190; 2-фенипзтилуретан-производное А80190;

30

35

40

45

50

171531861

циклопропилуретан-проиэводное

г по ж но но

А80190; 4-феноксифенилуретан-произ- водное А80190.

Пример 24. Получение метил- эфирного производиого А80190.

А80190 в кислотной форме растворяют в метаноле, добавляют воду (1/2 объема). Раствор оставляют до тех пор, пока не образуется эфирное производное. Раствор выпаривают под вакуумом. Продукт реакции хроматографи рутот, используя, например, сйликагел и получая метилэфирное производное А80190.

Примеры 25-27. Используя методику, подобную в примере 24, и соответствующий спирт или тиол получают следующие эфирные производные А80190: и-пропилэфирное производное А80190; метнлтиоэфирное производное А80190; и-бутилэфирное производное А80190.

Пример 28. Хроматографичес- кая идентификация А80190.

I. тех на силикагеле. Система: ацетонитрил - ацетон (1;1). Rf 0.59 Детектирование: Bacillus subtilis. Распыление смесью ванилин - .

Свиноматок откармливают при нормах 1,0 - 10 г А80190 на 100 фунтов (45,36 кг) корма. Лечебный корм предII. ЖХВП (жидкостная хроматография ЗО оставляется с водой. Обычно свиномат- вьсокой производительности), Адсор- и потребляют примерно 6-8 фунтов

35

40

бент: (uBondapak С ,j (4хЗОО-мм колонка) . Система растворителей: ацетонит- рип - тетрагидрофуран - вода (6:1:3), содержащая 1% НэРО. Доводят рН до 3,0 с помощью NH40H. Детектирование: рефрактометр. Скорость течения 3,0 мл/мин. Время удерживания 9,7 мин.

Пример 29. А80190 получают по методике примера 1, но используя Actinomadura oligosporus NRRL 15877 культуру.

Пример 30. Рацион цыплят, модифицированный А80190 для борьбы с кокцидиозом.

В табл. 6 приведен сбалансирюван- ный, вьсококалорийный рацион, приспособленный к откармливаемым цыплятам

для быстрого привеса.

«„а-

Эти вещества смешивают в соотвё - ствии со стандартными методиками .смет

|шивания кормов. Цыплята, откормленные таким рационом с водой, устойчивь

к кокцидиозу.

Пример 3l. Рацион мясного скота, улучшенный добавкой А80190.

В табл. 7 приведен сбалансирован-, ный сильно раздробленный рацион для мясного скота.

(2,72 - 3,63 кг) рациона в день.

Пример 33. А80190 - рецептура для поросят.

А801 90 растворяют в малом количе - стве этанола. Этот этанольный раствор суспендируется в полиэтиленгликоле 200. Суспензию концентрирует так, чт обы каждая единичная доза имела объем примерно 0,5 - 2 мл. Такие сус: пензии дают молодым свиньям при нор-, мах 0,5-50 нг на фунт три раза в день путем принудительного откорма.

Пример 34. Улучшенный ра- 45 цион (премикс) для борьбы со свиной дизентерией приведен в табл. 9.

Этот премикс добавляют к.обычному свиному рациону, используя стандарт- , ные методики смешивания кормов, получая конечный уровень активного соединения 100 г/т.

Показ синергического действия А80190 с никарбазином осуществлен следующим образом: бройлерных цыплят однонедельного возраста распределяют в клетки по пять птиц и откармливают, лечебным и контрольным рационами в течение одного дня, погле чего заражают ооцистами, вызьшающими кокциди55

18

Смешанный корм сжимают в кормовые гранулы. При среднеежедневиой норме поглощения, равной 15 Фунтов корма на животное, в корм вводят приблизительно 300 мг А80190 (Na-соль) на животное в день.

Пример 32. Рацион для свиней, улучшенный добавкой А80190.

В табл. 8 показан сбалансированный рацион для опоросных свиней.

Для 200 фунтов (90,72 кг) -этого рациона премикс получают добавлением А80190 (10 г) к малому количеству экстрагированного растворителем соевого корма. Этот премикс затем добавляют к 200 фунтам описанного свиного рациона, смешивая стандартными способами. Этот лечебный корм обеспечивает уровень 100 г А80190 на 1 т основного рациона. Лечебным кормом откармливают свиноматок в течение одного дня, предпочтительно 7-10 дней до опороа, введение этого корма после опороса также является желательным.

Свиноматок откармливают при нормах 1,0 - 10 г А80190 на 100 фунтов (45,36 кг) корма. Лечебный корм пред

ставляется с водой. Обычно свиномат- и потребляют примерно 6-8 фунтов

5

0

(2,72 - 3,63 кг) рациона в день.

Пример 33. А80190 - рецептура для поросят.

А801 90 растворяют в малом количе - стве этанола. Этот этанольный раствор суспендируется в полиэтиленгликоле 200. Суспензию концентрирует так, чт обы каждая единичная доза имела объем примерно 0,5 - 2 мл. Такие сус: пензии дают молодым свиньям при нор-, мах 0,5-50 нг на фунт три раза в день путем принудительного откорма.

Пример 34. Улучшенный ра- 5 цион (премикс) для борьбы со свиной дизентерией приведен в табл. 9.

Этот премикс добавляют к.обычному свиному рациону, используя стандарт- , ные методики смешивания кормов, получая конечный уровень активного соединения 100 г/т.

Показ синергического действия А80190 с никарбазином осуществлен следующим образом: бройлерных цыплят однонедельного возраста распределяют в клетки по пять птиц и откармливают, лечебным и контрольным рационами в течение одного дня, погле чего заражают ооцистами, вызьшающими кокциди5

ЬMe Me,

Лч /Ч

ofto Nj

которой R является водородом или

-CONHR ; R - алкил, арил, алкил-арип,

арилалкил, галоидарил, нит- роарил, галоидарилалкил, алкоксиарил, арилоксиарил, арилЦИКлоалкил, ациларил и пиклоалкил, или ацил, алкил сложноэфирное или алкил- эфирное производное.

№ 2 Рост: Хороший (влажная поверхность)

ОС: 61. Зелен.-желтый. Коричневый

ВМ: Отсутствует РП: Очень светло-коричневый№ 3 Рост: Плохой

ОС:93. Желтовато-серый

ВМ:Следы: черно-белый

Несколько разбросанных отдельных комков РП:Отсутствует

№ 4 Рост: Плохой

25

30

OR

или его соли, включающий культивирование штамма микроорганизма Actino- madura oligosporus NRRL 13877 или

штамма микроорганизма А.oligosporus NRRL 15878 на питательной среде, со держащей усваиваемые источники углерода, азота и неорганических солей в условиях глубинной аэробной ферментации при 30 - с последующим выделением антибиотика.

Таблица 1

Избыточный

Устричный

ОтсуОтсутстбует

Очень светло-коричне

Посредственный 5. Молочный. Розовьй Отсутствует

Отсутствует

От посредственного до

плохого

РП: Рост:

Лс-ОС; ВК:

РП: Рост:

Рост: ОС:

ВМ:

РП:

Рост: а

ОС:

ВК:

РП:

Рост: ОС:

Отсутствует Хороший (влажная поверхность) 90. Зеленовато-желтый. 26.

Желтый Отсутствует

Отсутствует

Избыточный (влажная поверхность) 79,1. Зел.-желтый. Желтый. Коричневый39,

Отсутствует

Отсутствует

Избыточный (влажная и,

поверхность)

Отсутствует

Темно-коричневый

Хороший

Красно-коричневый Отсутствует Хороший

S Желто-розовый

Посредственный . Белый - 7 са I Желт.-розовый Отсутствует

Хороший

Зел.-желтый. Красный. Устричный Следы. 2 Яелый (только кромки) Отсутствует Избыточный (влажная поверхность)

Темно-коричневьв

Незначительные след

Се рый

Темно-корнчневьп

Посредственный

Темно-желтый

Черный

ВН:

РП:

я Рост: ОС: ВМ: РП:

Посредс твенный

е. Белый

Отсутствует

Посредственный

Отсутствует

Отсутствует

Адонит L-Араб

Целл

Деке D-Фрук D-Гала D-Глюк -ин

Инул D-Лактоза

Каннит D-Манноза D-Мелезит

Примечание - устойчив (отсутствуют зоны ;

ангибирования); - - чувствителен (зоны ингибирования).

Отсутствует Отсутствует Посредственный S Желто-розовый Отсутствует Отсутствует

± - сомнительный ес35ли использует{;я;

НП - не проводили испытания .

Таблица 3

Сходства

Морфология

Физиологическиесвойства

Синтез полиэфираДефицит воздушных гифов

Образование воздшуных фов Картина использования лерода

Каталазная деградация аде нина

кальциевой соли яблной кислоты казеина хитина ДНК эластина эксулина желатины гуанина гипоксантина кератина крахмала тестостерона тирозина ксантина

Культивирование в жидк

среде

Культивирование на бут рате Na

Продуцирование H S№ланоидные пигменты Толерантность к NaCl,

Т

Таблица 4 Различия

Антибиотическая устойчивость

Картина использования угле рода

Культурапьные характеристики

Деградация эскулина, деградация гипоксантн- на, редуцирование нитрата

Форма и размеры спор Температурньй предел Продуцирование уреазы

Таблица 5

Редко

(см. табл. 2)

+ +

« +

Красно- оранжевый

Редуцирование нитрата Фосфатаза Синтез полиэфира Картина устойчивости к атибиотикам

Устойчивость к лизоциму Окраска обратной стороны

Растворимый пигмент Пепи спор Поверхность спор Температурпьй предел,°С Продуцирование уреазы Форма спор Размеры спор

Соевая мука со снятой кожице экстрагированная растворителем, тонко размолотая, 50% белка

Животный жир (топленый говяжий жир)

Высушенная рыбная мука с растворимыми веществами (60% белка)

Кукурузная барда с растворимми веществами Дикальций фосфат, кормовой сорт

Карбонат кальция Витаминньй премикс (представляющий витамины А, D, Е, К и В , холин, ниацин, пант геновую кислоту, рибофлавин, биотин с глюкозой в качестве наполнителя)

Следы минерального премикса (представляющего , КС, FeSO, CaCOj) 2-амино-4-оксимасляная кисло (оксианалог метионина) А80190 (Na-соль)

f +

4

(см.

.табл. 3) Не проводили Коричн. -

-орянж. Коричневый

R - И Гладкая 15-37

Продолговатая Овальная

От 0,5-0,7 до От 0,8-1,0 до

0,9-1,,2-2,Орг,

31,09 282,05 (621,8) 6,5 58,97 (130)

0,5

4,54 (10)

1,81 (4)

0,91 (2) 0,09 (0,2)

29

Тонко размолотая кукуруза Молотая кукурузная початка Обезвоженная люцерновая мука, 17% белка

Содержащий на фунт (453,6 г): 2,000.000 М.Е. витамина А, 227.200 М.Е. витамина Dj. и 385,7 г соевого корма с добавлением 1% масла.

Сухая кукурузная барда с растворимыми веществами, содержащими 20.000 М.Е. 0-альфа-токоферипацетата на фунт.

Молотая желтая кукуруза Соевая масляная мука со снято кожицей, экстрагированная растворителем

Высушенный свекловичный жом Дикальций фосфат I Карбонат кальция Свиной витаминный премикс Соль (NaCl) Холин хлорчц, 25% Следы минерального премикса

1531861 0

Таблица 7

67у8 615,08 (1356) 1090,72 (200)

5А5,36 (100)

Т а б л и ц а 8

65,10 590,59 (1302)

167,83 (370)

90,72 (200)

26,31 (58)

10,89 (24) 9,98 (22) 4,99 (II) 3,175 (7) 1,36 (3)

31

Составная часть

Витамин А - премикс « Окси-аналог метионина

1 кг прейикса содержит следующие составные части: 77.161 Е. Государственной фармакопеи США (USP) витамина Dj; 2,205 М.Е. витамина Е; 441 мг рибофлавина; 1,620 мг пантогенной кислоты; 2,205 мг ниацина; 4,4 мг витамина В,; 441 мг витамина К; 19,180 мг холина; 110 мг 4юлиевой кислоты; 165 мг пиридоксина; ПО мг тиамина и 22 мг биотина.

кг премикс а содержит следующие составные части: 50 г марганца в виде сульфата марганца; 100 г цинка в виде карбоната цинка; 50 г железа в виде сернокислой ,-соли закиси железа; 5 г меди в виде окиси меди; 1,5 г йода в виде йодида калия и 150 г максимум и 130 г минимум кальция в виде карбоната кальция.

1 кг премикса содержит 6,6138 00 USP Е. витамина А.

Составная часть

Активное соединение

Силикат кальция

Карбонат кальция

(мука из устричной

скорлупы)

9,13 9,13 8,88 8,90 8,66 0,08

8,63 5,13 1 ,63 0,56 0,0

153186132

Продолжение табл.8

Содержание

%

кг/т (фунт/т)

0,10 0,05

0,9 (2) 0,54 (1)

Таблица 9

Содержание, г/кг

Табли да 10

3,50 0,13 0,0

1,19 0,0

0.0

33

1531861

- 34 Таблица II