Способ получения деацетоксицефалоспорина с Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

I

Изобретение относится к микробиологической проьвлаленности, а именно производству антибиотиков.

Известен способ получения деацетоксицефалоспорина С химическим путем 1 .

Однако такой способ сложен и трудоемок .

С целью упрощения способа получения деацетоксицефалоспорина С формулы

б

О И

Сй-(П1,)з-с4т-А

ТШо

Шз

соои.

штамм - продуцент пенициллина N , относяпдайся к роду Ceph,atosporlum Emertcettopsis, Scopula гСорьСь , Paecitomy sesили В1Ке1его«рогс1

культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, а затем из культуральной жидкости выделяют целевой продукт.

Из рода dephaEosporLum. выбирают штаммы

dephatospoKuTTi Korda NRR-t.

Cepkatosporcum chrysogftnum ЯСС

Cepttatosporium up,NRRL

CephaEosporium sp. NR.KL

CepKatosporiom 6p.NR.Tlb

daphatosporCum sp, NRB.L

CepKci ospDritjm ьр. NR.R.L.

Ce.ph.a ObporCuni sp. fyfRRL

CupKaCosporCum sp. NR.R.L

CeptiatobporLUTn. bp. NRRt

CepKatosf orium sp, NR.KL,

CcpKatospoKum bp.Kft.Rb

Из рода EmerCcettopstsрают штамм fcJ:

bmerLce op«is sp. NRE.U

5446, Emericef otisis sp. 5713, Emari-ct opsrs sp. NRfib 5714 или Emerice opSS sp. NRRt. 5717.

Из рода ScoputaT-LOps.LS выбирают Штамм ScoputariopsiS ер. NRRb 5715, из рода PacCLfomifces выбирают штамм: РагссЕотпусез carriftus

NRRL. 5711, а из рода DLHeteгоЕроч а выбираиот штамм DLfteterospora cKEaiTiLdospara NRRb 5728.

Предлагаемые штаммы известны, описаны в литературе и их используют

для получения пенициллина N (цефалоспорина Ы ).

Предлагаелие штаммы культинируют при перемешивании в колбах емкостью 1 л и получают небольшое количество деацетоксицефалоспорина С. Для получения большого количества штамдвл культивируют в ферментерах больших размеров в условиях глубокой аэробной ферментации.

Для получения деацетоксицефалоспорина С споры организма выдерживают на косом агаре. Споры с косого нэгара используют для( прививки растворителей среды небольшого объема. Вегетационную среду выдерживают в термостате до получения обнльной ратущей культуры микроорганизма. Эту вегетационную среду затем используют в качестве прививочного материала для ферментационной среды, применяемой в больших количествах.

В некоторых случаях дополнительно вводят вегетационную среду в качестве прививочного материала для ферментационной среда. Такую вторичную вегетационную среду обычно используют, если объем ферментационной среды значительно больше объема первой вегетационной среды. Вегетационную среду большого объема затем вносят с подходящей концентрацией микроорганизма для инициирования начинающейся ферментации в ферментерах больших размеров. Вегетационная Среда может имет такой же состав, как и ферментационная или оиа может содержать дополнительные компоненты для роста и развития микроорганизмов.

Образование деацетоксицефалоспорина С происходит при рН от 6,2 до 8,0, предпочтительно рН €,5-7,5.

Культивацию веДут при температуре 30-35 с. Оптимальный выход деацетоксицефалоспорина С происходит при температуре 26°С.

Максимсшьный выход деацетоксицефалоспорина С при культивировании штамма в больших емкостях происходит в течение 4-7 дней, но если культивирование велут в колбах емкостью 1л, то штамм растет гораздо быстрее и продуцирование деацетоксицефалоспорина С происходит за 2-3 дня.

Бели рН ферментативной-среды достигает 8,0 или выше, то это неблагоприятно влияет на выход деацетоксицефашоспорина С, поэтому необходимо контролировать время и значение рН ферментационной среды в процессе ферментации. рН среды понижают добавлением в ферментационную среду подходящей кислоты или подходящего буфера.

Присутствие деацетоксицефалоспорина С в ферментационном бульоне определяют хроматографией, а также посредством биоавтографов. В качестве

определяющего организма для биоавтографов используют Pseudomonos бойласмгеиж

Стерильный воздух пропускают через культуральную среду для повышения выхода деацетоксицефалоспорина С. Объем воздуха, проходящего через культуральную среду, составляет 0,2 об.ч. воздуха и 1 мин на 1 объел) культуральной среды.

Для извлечения деацетокбицефапо0спбрина С из ферментационной среды обрабатывают весь ферментационный бульон крроткое время в кислой среде для разложения некоторых из сопутствующих примесей.

6

Деацетоксицефалоспорин ; С отделяют от других компонентов ферментационной среды хроматографией на ионообменной смоле, а затем очищают хроматогра ей на целлюлозе или силика0геле с последующим рсаждением и перекристаллизацией.

Сначала отфильтрованный ферментационный бульон подвергают предварительной очистке экстракцией органиsческим растворителем, не смешивающимся с водой, например н -бутанолом или амилацетатом, с целью удаления примесей. Экстрагированный бульон подвергают очистке хроматографией

0 на активированном угле, и колонну промывают водой для удаления водо-. растворимых окрашенных примесей и водорастворимых неорганических веществ. Продукты ферментации затем элюируют из угля 50%-ной смесью ацетона с водой.

Элюат концентрируют до водной фазы, которую затем хроматографируют над основной анионообменной смолой. Смолы используют гидроксильного, ацетатного или формиатного типа, полистирольные смолы типа четвертичного аммония или других подходящих типов. Концентрированный злюат, поступающий из колонны с активированным углем, выливают на анионообменную смолу, после чего смолу промывают водой Деацетоксицефалоспорин С злюируют из обменной смолы в виде соли с подходящим слабым основанием, например,

0 при использовании колонны со смолой ацетатного типа в качестве элюирующего растворителя применяют водный раствор ацетата натрия в концентрации Hi или менее. Для предот6вращения образования избытка неорганической соли (ацетатнатрия) в злюате из Ьбменной колонны, концентрация ацетата натрия должна быть 0,10,5 н.

О

При использовании обменной смолы формиатного или другого подходящего типа используют соответствующую соль в 1 н, растворе вкачестве растворителя для элюирования, например,

5 формиатаммония. Многочисленные фракции собиргкот, и фракции, содержащие деацетоксицеФалоспооинС, соединяют

Соединенные элюаты хроматографируют над активированным углем для удаления избытка неорганических солей, например, ацетата натрия, применяемого в виде элюирующего раствора. Колонну с активированным углем проживают водой для удаления неорганических водорастворимых солей, и деацетоксицефалоспорин С элюируют из колонны 50%-ной смесью ацетата с водой. Элюат упаривают досуха или упаривают до удаления ацетона, а концентрированный водный раствор лиофилизируют и получают деацетоксицефалоспорин С в виде неочищенного твердого продукта.

Неочищенный продукт деацетоксицефалоспорина С подвергают дальнейшей очистке хроматографией над целлюлозо или силикагелем или над другим подходящим неионным адсорбентом. Деацетоксицефалоспорин С элюируют из колонны растворителем, содержащим ацетонитрил и воду (80:20), и собирают многочисленные фракции. Фракции, содержащие деацетоксицефалоспорин С, определяют бумажной хроматографией, соединяют и концентрируют до небольшого объема или досуха. Высококонцентрированный водный остаток или сухой остаток растворяют затем в минимальном количестве изопропилового спирта, и спиртовой раствор выливают в большое количество диэтилового эфира.

Очищенный деацетоксицефалоспорин получают в виде соли, соответствующей водному элюирующему средству, применяемому для элюирования анионообменной смолы. Например, при-использовании ацетата натрия в качестве элюирующего средства получают деацетоксицефалоспорин С в виде мононатриевой соли.

Деацетоксидефалоспорин С в форме соли отфильтровывают и высушивают.. Соль деацетоксицефалоспорина С можно превратить в свободную кислоту, например, пропусканием через катионообменную смол .

Хроматографию для идентификации деадётоксицефалоспорина С в неочищенных ферментационных бульонах или во фракциях элюатов смол осуществляют на хроматографической бумаге ватман 1 по восходящему методу. Система растворителей, применяемая для проявления, состоит из ацетонитрила и воды (80:20 об.ч.); камера насыщена парами растворителя следующего состава: п -пропанол - пиридин уксусная кислота.-ацетонитрил-вода в соотношении 45:30:9:40:36 (об.ч.), С целью упрощения хроматографии испытуемый образец предварительно обрабатывают пенициллиназой.

Пример 1. Отделенные споры штаммов Сгр|га ospOT-ium &р. NRRL 5445, Cepka QsporCum ch.rySQgenum АТСС 14 615, pT4ericeetopsi.s sp. NR-RL 5446 и Emarice-EEopSLS sp. NRRL

5447 no отдельности прививают на косой агар со средой следующего состава, %:

Лактоза1,000

Глицерин1,000

Соевый пептон0,250

Растворимые высушенные кукуруза и солод0,250

Гептагидрат сульфата магния0,050 Гептагидрат сульфата двухвалентного железа 0,001 Карбонат кальция 0,200 Раствор микроэлементов О ,625 Агар 2,000 Вода Остальное Косой агар термостатируют 7 дней при температуре . Зрелые культуры заливают стерильной дистиллированной водой и осторожно соскабливают стерильной палочкой для получения споровой суспензии.

Полученные споровые суспензии применяют для прививки двух отдельных стерильных вегетационных сред следующего состава,%:

Соевая мука2,000

Солодовый экстракт2,000

Кукурузный экстракт0,500

Гептагидрат сульфата магния0,025 Монокалийфосфат0,100 Дикалийфосфат0,050 Дигидрат хлорида кальция0,010 Раствор микроэлементов0,625 Вода Остальное

Перед автоклавированием доводят рН среды до 6,5. Привитые вегетационные среды термостатируют 48 ч при 26С с применением вращающегося аппарата для взбалтывания. Затем эти среды используют в качестве прививочного материала для ферментационной среды при соотношении 1% вегетационной среды на 1 об.ч. ферментационной. Применяекие для этой цели среды имеют следующий состав, %:

Сахароза4,0

Глицерин1,0

Глутамат натрия0,5

Арахисовая мука2,0

Гексагидрат двойного сульфата аммония и двухвалентного железа0,3 Нитрат калия2,0

Карбонат,кальция 0,3

Вода Осаальное

При ферментации большого количества продукта используют поверхностноактивные вещества или антивспениватели. Перед стерилизацией доводят рН среды до 6,5, Затем непривитые ферментационные среды термостатируют 5 дней при 26°С и при перемешивании. Во время ферментации через ферментационные среды пропускают воздух со скоростью 1/2 объема на 1 объем культуральной среды в 1 мин. Конечное значение рН ферментационных сред 7,5. 15 л полученного бульона подкисляют до рН 2 серной кислотой. Подкисленные цельные бульоны перемешивают 1 ч при комнатной температуре, после чего подщелачивают до рН 6,0 раствоDOM гидроокиси натрия.

Бульоны отфильтровывают, и водный фильтрат экстрагируют п -бутанолом для удаления нерастворимых веществ в суспензии. Затем водные фазы пропускают через колонны, заполненные активированным углем, и колонны про1ллвают дистиллированной водой. Элюаты прокивных вод отбрасывают. Далее колонны элюируют 50%-ным водным ацетоном. Элюатн упаривают под вакуумом до водной фазы, которую хроматографируют в колоннах, заполненных полистирольной смолой, содержащей группы четвертичного аммония и ацетатного типа. Колонны сначала промывают водо и промывные воды удаляют.

Активные продукты ферментации элюируют из колонны 0,15 н. раствором ацетата натрия. Многочисленные фракции собирают, и фракции, содержащие деацетоксицефалоспорин С, соединяют.

Присутствие деацетоксицефалоспорина С во фракциях элюатов определяю хроматографией восходящим методом с применением бумаги ватман № 1.

В качестве элюирующего растворителя применяют смесь ацетонитрила с водой (80:20). На дно хроматографической камеры наслаивают смесь растворителей, содержащую 300 мл раствора состава, %: п -пропанол 37,5, пиридин 25, уксусная кислота 7,5, вода .30, который разбавляют до 100 мл ацетонитрилом.

Деацетоксицефалоспорин С определяют также при помощи микроорганизма вида Pseudomo-nou bofancearcumПолученные фракции деацетоксицефалоспорина С после хроматографии соединяют. Объединенные фракции абсорбируют на колонне, заполненной активированным углем. Колонну сиачаЛс промывают дистиллированной водой для удаления растворимых неорганических веществ, например ацетата натрия, а затем элюируют 50%-ным водным раствором ацетона. упармвают под вакуумом досуха. Получают неочищенный твердый препарат натриевой соли деацетоксицефапоспорина С, который очищают хроматографией на колонне, заполненной целлюлозой,.

Антибиотик элюируют из колонны с целлюлозой смесью раствооителей, содержащей ацетонитрил и воду (80:20). Многочисленные фракции собирают, и при использовании хроматографической систелвл, описанной выше, фракции, в которых обнаружен цефалоспорин С, соединяют. Соединенные фракции концентрируют досуха, а сухой остаток, содержащий деацетоксицефалоспорин С растворяют в минимальном количестве изопропанола. Спиртовой раствор выливаиот в эфир, количество которого превышает в 20 раз объемное количество изопропанола. При перемешивании образуется осадок натриевой соли деацетоксицефалоспорина С. Его отфильтровывают и высушивают на воздухе. Получают 126 мг антибиотика в виде натриевой соли.

Пример2. По методике, описанной в примере 1, споры EmcriceftopSLS ьр. NRRL 5714 культивируют на вегетационной среде. Культуральная среда, применяемая для прививки продуцирующей среды имеет следующий состав, %:

Растворимый крахмал 1,0 Декстроза4,0

Соевая крупа1,0

Карбонат кальция 0,5 Антивспениватель 0,1 ВодаОстальное

Перед автоклавированием и прививкой доводят рН продуцирующей среды до 6,5. Ферментацию проводят 5 дней при 26°С. Деацетоксицефалоспорин С извлекают и выделяют согласно примеру 1.

При мер 3. Аналогично примеру 1 споры ScopyCarCopsis ьр- NRRU 5715 культивируют на вегетационной среде, описанной в примере 1. Вегетационную среду применяют для прививки ферментационной среды, состав которой также описан в примере 1.

Ферментацию осуществляют 5 дней при , и деацетоксицефалоспорин С извлекают из ферментационной среды согласно примеру 1.

П РИМ е р 4. Аналогично примеру 1 проводят культивирование и ферментацию POWiEom у с es с получением деацетоксицефалоспорина С.

П р и м е р 5. По той же методике культивирования и выделения, а также с использованием среды, описанной в примере J, выраЕцивают DeKeterospOY-a ckCawy dnapo Ca с получением деаиетоксицефалоспорина С.

Формула изобретения

1. Способ получения деацетоксицефалоспорина С формулы

О Н

HOOC-CH-(CH2)3-C-i ЯНд

соон

отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, штамм продуцент пенициллина К , относящийся к роду depkatosporCuTn ,

ScopyfartopsCa, EmftrictpeopsilS, Paeci fonriMces .DLheterospora культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, а затем из культуральной жидкости выделяют целевой продукт.

2. Спсооб ПОП.1, о тли ч а rota и и с я тем, что из рода Ceph.atoSporLumвыбирают штамм;

Korda NRRL

5445, cKrysog-enum

ATCC 14615, sp. fJRRL 5712, sp klRRL 5716, 6p NRRL 718,

CeptiaEosporiutn sp, KRRL5719,

CepfiaEosportum sp. NR.RL5720,

Cephatosporiom sp. HRRL5721,

CepfiaEasporLum sp.HRRu5722,

Ccphaeosportum sp WRRL5723,

Cephatosporium 6p NRRL5724 или

C ephaEobpOTium sp. NRRU5725,

из рода Erne rice sis выбивают штамм:

EmerCcegfopSLS sp. NRRb5446,

EmerLcetEopSLs sp. NRRL5447,

EmericettopSLS sp. NRRL,5713,

EmerCceftopSLS sp. NRRL5714 или

EmericeEtopsLS sp. NRRL5717,

из рода ScDpuEartopsis выбирают штамм ScopufariopSLS sp. NRRU 5715, из рода PaecilEoTnyces выбирают штамм Paecuiomyces carTi«us NRRL 5711, из рода DLKettrospora выбирают штамм DihetCi ospo ra tWamydospora NRRL5728.

Приоритет no пунктам и признакам

26.04.72 по п, 1 и по признакам п. 2, касающимся использования штаммов 5445, 14615, 5446, 5447;

09. 04 .,73 по остальным признакам п.2.

Источники информации, принятые в внимание при экспертизе:

1. Патент США 3124576, кл. 260-243, 1964.