Способ получения антибиотика Советский патент 1976 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение отноштся к микробиологической промышленности. В доступной патентной и специальной литературе описания способов получения антибиотика с использованием указанной культуры найдено не было. Предаоженный способ-получения антибиотика заключается в том. что культуру .Acti пор lanes utahenesis NRRL 5614 выращивают на феде, содержащей источники углерода, азота и неоргаютюские.соли, с последуницим выделением и очисткой целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами. Предлагаемый антибиотик включает два пептидных активных компонента А и В, Эти компопенты структурно связаны друг с и проявляют химические, физические и спектральные свойства, аналогичные дая пептидов. Компошнты сопутствуют ферментации и получаются в виде смеси. Их отделяют друг от друга и изолируют, как индивидуальные соединения. Смесь активных компонентов А т В представляет собой белую пудру, растворимую в воде и низших спиртах, но нерастворимую в большинстве органических растворите.(1ей. Активньп компонент А - белое аморфное соедине:дае, не расплавляемое при температгфах ниже 220° С, Элементарный анализ, %: углерод 44,98, водород 6,15, азот 10,28, кислород 26,37, остальное 4,14. Компонент Л имеет молекулярный вес около 1500,определенньш в метаноле осмометрическим методом. Компонент А абсорбируется в ультрафиолетовом районе спектра и показывает максимумы абсорбции в воде при Хмзкс. 220 тм (v . 9,500; ycTjn) и273тм (12,700); в оснэваши mni кис лоте изменешш ш происходит. Активный компонент В - белое аморфное соединение, не имеющее отчетливой точкч плаалешм, но обугливающееся при температуре 200°С, Злементарньш анализ, %: углерод 49,96, водород 6,98, азот 9,90, кислород 23,86, остальное 4,66. Молекулярньш вес компонента В , определен в метаноле осмометрическим методом. Компонент В абсор&фуется в ультрафиолетовом районе спектра и показьгоает абсорбционные максимумы в воде при . 220 тм (Б 9,200; уступ) и 273 тм (2 3,200); в основании или кислоте изменения не происходит.

Электрометрическое титррйание показьтает постоянный расход основания, что отличительной особенностью циклических пептидов.

.Компоненты А и 5 и их смеси значительно растворимы в воде и в таких низших, спиртах аю бутанол и метанол. Они нерастворимы в большинстве органических растворителей таких как, например, даэтиловый эфир.

Антибиотик и его активные компоненты предотвращаюу рост микроорганизмов, патогеничных к животным и растениям. Кроме того, антибиотик и его компоненты обладают нротивопаразитным и ускоряницим рост действием.

Антибиотическая смесь и компоненты особешю действенны против патогенических грамм-положи тельных бактерий как вне, так и в организме, и могут использоваться для лечения и контроля заболеваний, вызьтаемых этими бактериями.

. Активный компонент В в минимальных количествах присутствует в антибиотической смеси. Активность компонентов А vi В вне организма совершенно одинакова. Таким образом, разделение зтих двух компонентов, используемых при обработке и кон1роле болезнетворных организмов или в качестве ускорителей роста, не является существенным.

Острота токсичности антибиотика, определенная при внутрибрюшинном введении мышам и выраженная как LDso состзвляет 1370-МГ/кг. Сь«ртельных случаев не было при оральном введеНИИ мыщам 1250 мг/кг акш5иописа.

Противомикробное действие антабиотика в организме наблюдают при его введении мышам или парзнтерально или орально.

Полезным свойством антибиотика является era способность улучшать ростовую характеристику животных. При добавлении к пище растущих цьшлят45,4г на 1 т корма средний весовой прирост после 10 дней составляет 159,9 г, по сравнению со средним весовым приростом 146,1 г для Контрольной группы. Способность антибиотика стимулировать весовой прирост делает его особенно полезным для увеличения продукции животноводства. При использовании его в качестве ускорянщего рост агента можно применять соответствующие концентрации а1ггабиотика в нормальном Пищевом рационе животных. Антибиотик зффективен как ростоускоряннций агент при введении животным в дозах от 10 до 1,0 г на 1 т пищевого рациона.

Антибиотик является противопаразитным areaтом, в особенности эффективен против рецидивной лихорадаи, вызьшаемой спирохетой Borrelianovyi, при парэнтеральном введении в примерной дозировке от 10 до 500 мг/кг.

Антибиотик может быть использован как поверхностш ш дезинфектант. Растворы, содержащие дэва процента антибиотика, являются эффективными для целей .дезинфекции. Такие растворы, содержаище также детергент или другой очищающий агент, являются полезными для дежнфекции стеклянных изделий, зубных и хирургических инструментов, а также стен, полов и столов в помещениях, где важно поддерживать стерильные условия, т.е. в госпиталях или помещениях для дриготовления шшш.

Новый антибиотик получают путем вырапдавания производящего штамма из Actinoplanes орга1шзма в условиях аэробного погружения в соот; ветствующей культуральной среде. Антибиотики извлекают с помощью различных обычно используемых и известных методов выделения и очистки.

Микроорганизмом, пригодным .для приготовления антибиотика, является разновидность класса Actinoplanes, семейства Actiпорlanaceae, порядка Actinonrjycetales . i

Пришлет йия;ироизводс1ва, kyntтура Actinoplanes хранится в коллекции культур Северного отделения прикладного исследования и развития Министерства сельского хозяйства США, Пиория, Иллинойс 61604, известна под Номером NRRL5614...

Культура, производящая антибиотик, классифип 1рована как новый штамм Actinoplanes utahenesis Couch.

Морфология.

Вегетативный мицелий. Гифа на синтетической и полусинтетической агаровой среде является длинной, разветвленной, разделешой перегородкой и имеет от 0,2-до4 2 мкм в диаметре,1:На.поверхностц агара мицелий образует компактньш, слегка поднятьш и иногда похожий на кожу рост. Воздущные гифы не образуются на любой среде. Вертикальные гифы в изобилии находятся ниже новерхности агара. Каждая вертикальная гифа берет начало из горизонтального слоя шф, которьш в изобилии находатся более глубоко в агаре и заканчивается на поверхности агара с образованием спорангия.

Спорангий. В изобилии образуется на агаре Чапека. Появляется после семи дней инкубации при 22-25°С. По мере роста вся поверзшость колонии Покрьшается плотной спорангиальной подстилкой. Спорангий рождается разрозненно на очень коротких спорангноспорах (концевая часть вертикальных шф над агаро.вой поверхностью). Иногда шорангийоспоровые ветви дают начало вторичному или, редко, третичному спорангию. Спорангий обычно имеет сферическую или субсферическую форму и может быть до 8-Шмкм, Он содержит 35-50 шорангиоспор, которые расположены в одном или более вьшуклых кольцах в спорангии. При зрелости шорангиоспоры имеют диаметр 1,0 мкм. Спорангиальное раскрытие всегда появляется при общем И31 «льчении спорангиальной стенки. Процесс высвобождения спор обычно начинается спустя 10 шш15мин после помещения спорангия в воду. Обьмно споры не становятся подвижными сразу, но становятся активно подвижными при действии пучка полярной флагеллы в течение - мин.

На агаровом растворе Чапека. Хороший рост, точечньш.прививочный материал в течение 4 недель.

дает колонию в диаметре около 1 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония обычно имеет незначительное цгитральное поднятие. Цвет колонии вначале ярко-оранжев ьш и становится тускло-оранжевым, когда образуется сторангий и покрьтает мицелий.

Пептоновьш агар Чапека. Прекрасньш рост; точечньш и прививочный материал в течение 4 недель дает колонию диаметром около 0,5 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония обычно

ровная, рассеянная и слегка слизистая. Цвет колонии тускло-коричневатый, оранжевьш. Спорангий не производится,

Anio -Henssen агар. Црекрасный рост; точечный прививочный материал в течение 4 недель дает колонию диаметром около 0,5 см. Воздушные гифы не наблюдаются. Колония является гороподобной, именицей острую вершину, в центре с острыми гребнями, выдаюшлмися к краям колонии. Цвет колонии от ярко-оранжевого до жел то-оранжевого. Спорангий образуется в большом числе в старой части колонии, но не до такого размера, как при образовании на растворе агара.

Химический состав системы клетка-стенка.

Клетка-стеночный химический состав Actinoplanes utahenesis NRRL 5614 подобен штаммам Actinoplanes utahenesis.

Actinoplanes utahenesis NRRL 5614 может расти в культуральной среде с получением ад тибиотиков: Культуральная среда может быть любой из ряда известных, однако для экономии продукции, максимального вькода и легкости выделения ашиЁиотшсов предпочтительной является определенная Культуральная феда. Одним из предпочтительных источников углеводов является патока, источников азота - соевая мука.

В культуральную среду должны быть введены питательные неорганические соли, которые представляют собой обьинь1е соли, способные приносить натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, хлорид, сульфат, ацетат и карбонат. Кроме того, вводят такие источники ростовых факторов, как барду и дрожжевые экстракты. В культуральную среду для . выращивания Actinoplanes sp. включают и сопутствующие элементы. .

Начальное значение рН культуральной среды южет изменяться. Однако перед прививкой с организмом доводят рН культуральной среды до 6,8 и 7,5 в зависимости от конкретной используемой средах. Конечное значение рН определяется начальным значением рН буферных веществ, присутствующих в среде, и период;ом времени, в течение которого организм может расти.

Для производства значительных количеств антибиотика используют затопленную аэробную ферментащю в резервуарах. Малые количества антибиотика получают из культуры во встряхиваемой склянке. Вегетативную прививку осущест-, вляют путем прививания малого объема культуральной среды со споровой формой или фрагментами мицелия организма для получения свежей, активно растущей культуры организма. Затем вегетатив1тую прививку переносят в больший резервуар. Используемая для выращивания вегетативной прививки среда может быть такой же, как и используемая для больших ферментации, но может быть использована и другая.

Антибиотик, производящий организм, может выращиваться при 20 и 35° С, оптимальная температураоколо 30°С,

Стерильный воздух продувают через культуральную среду. Для производительного выращивания организма и антибиотиков объем используемого в резервуаре воздуха составляет более 0,1

объема воздуха в минуту на объем культуральной

среды. Оптимальный рост происходит при объеме

используемого воздуха между 0,6 и 1,0 объемами

воздуха в 1 мин на объем культуральной среды.

Производство антибиотиков контролируется в

течение ферментации путем исследования образцов бульона на антибиотическую активность против организмов, известных своей чувствительностью к антибиотикам. Одним из испытательных организмов является Sarcina lutea АТСС 9341.

Максимум производства антибиотической активности достигается в период от 20 до 94 час.

Антибиотическая активность во время ферментирования производящего организма имеет место в антибиот «еском бульоне. В соответствии с этим

используемые в производстве антибиотиков методы вьщеления выбирают для обеспечения максимального извлечения антибиотиков из бульона. Поэтому, например, мицелий и нерастворимые твердые вещества удаляют из ферментационного бульона обычными способами, (фильтрацией), а антибиотики удаляют из отфильтрованного бульона экстракцией или абсорбцией.

Штамм Actinoplanes NRRL 5614 производит антибиотический компонент А, как преобладающий

компонент. Компонент А составляет примерно от 95 до 98% общей извлеченной антибиотической активносвг. Компонент В составляет остаток антибиотической активности.

Низшие спирты, такие как бутанол и центанол,

являются подходящими растворителями для экстрагарования профильтрованного бульона. Дальнейшая очистка антибиотика включает дополнительные операции экстракции и абсорбции. .Для этого с успехом MorjT быть использованы такие

абсорбтивные материалы, как Sephadex G 25 или G 50, или алюминий.

.тивные компоненты А vi В отделяют друг от друга и вьщеляйт в качестве индивидуальных соединений с известньк методов - противоточным распределением, препаративной тонкослойной хроматографией или колонной хроматографией. Предствителями адсорбентов для колонной хроматографии служат: алюминий, элюируюш 1Й фактор В с метанолом и с 2%-ным аммонием в

метаноле; ДЕАЕ - целлюлоза при градиентном

элюировании с 0,001 М до 0,2 М буферным раствором уксуснокислого натрия, рН 5,6; катионоо менная смола (ХЕ-64 в водородном цикле), элюирование с 0,05 М цитратным буферным раствором с градиентным изменением рН от 5,2 до 5,8. Противоточное растределение является предпочтительным методом разделения. Хорошие результаты при зтом методе достигаются, если одна фаза является полярным, не смешивающимся с Ьодой расгворихелем, или растворной смесью, и другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области 5,. Оптималыак результаты достигаются, когда одна фаза является такой растворной системой как, например, мепшизобутилкетон: бутанол или этилацетат: этанол, а другая фаза является буферным раствором, имеющим рН в области 6,8-7,0.

Пример.

А. Ферментирование антибиотика во встряхиваемой склянке.

Культуру Actihoplanes utahenesis NRRL 5614 приготавливают и помещают на агарный уклон, ; имеющий следующий состав: овсянка (предварительно сваренная) 65 г, агар 20 г, деионизированная вода 1л.

Уклон прививают с Actinoplanes utahenesis NRRL 5614 и выращивают приЗО°С от 10 до 14 дней. Полученный в мицелии пигмент изменяется от ораюкевого до оранжево-коричнзвого. Культура не нормально опоршшровала на зтой среде; поэтому необходимо вымочить мицелиальньш мат ровнЬй заостренной прививочной 1Ялой, чтобы увеличить число потенциальдых центров роста. Размоченную созревшую культуру покрьшают стерильйой водой и осторожно сясоблят стерильньп прутом для получения мицелиальной суспензии. Эту суспензию сохраняют лиофилизацией. 1/6 часть приготовленной уклонной культуры используют для прививки 50 мл вегетативной среды следуилцего состава (г):

Овся1п а (предварительно

сваренная)20 О

Триптон5 О

Сухие дрожжи2,5

Деионизировашш вода 1(л).

Начальное значение рН вегетативной среды приблизительно 7,2; после 72 час рН составляет 6,6-7,0. Вегетативн то среду прививают и выратцивают Б склянке (250 мл) при 30° С в течение 72 ча на ротационном встряхивателе при 250 об/мин. Конечные твердые вещества составляют 20-30%.

Б.Ферментация в резервуаре.

Вегетативную среду- (1,25л), приготовленную как описано вьпде, используют для прививки 25 л стерильной продуктивной среды следующего состава (г):

Сахароза10,0

Соевый ырет10,0

Патока30,0

Энзиматический гидролизат казеина4,0

К2НР041,0

MgS041,0 Dow Cbrning antifcam

(антивспениватель)0,2

Минеральная смесь Чапека5,0 (мл)

Водопроводная вода25 (л).

После стерилизации в автоклаве при в речение 30 мин рН среды равно 7,2. Привитую продзостивную среду помещают для ферментирования в течение 5 дней при 30° С в 30-литровый ферментационный резервуар. Ферментационную среду продувают стерильным воздухом со скоростью 1 объем воздуха на объем культуральной среды в минуту и перемешивают в обычной мепилке при 400 об/мин.

П р и М е р 2. Выделение активных компонентов.

Ферментационньш бульон (25л), полученный по примеру 1, профильтровывают с вспомогателькым фильтровальным порошком (Hyflo Super-eel диатомовая земля), рН фильтрата бульона доводят до при разбавлении соляной кислотой, а затем фильтрат дважды экстрагируня с бутанолом. Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом с получением масла. Масло растворяют в буферном {йстворе фосфата натрия (0,1 М, рН7,0), и буферньш раствор трижды экстрагируют с бутанолом. Бутанольньш экстракт вьшаривают под вакуумом досуха. Остаток растворяют в метаноле; для осаждения антибиотически смеси добавляют эфир. Осадок отделяют центрифугированием и высущивают в вакууме с полз ением .рыжевато-коричневой пурры (вьосод из исходного 4 1льтрата примерно 50--65%). Этот остаток дополнительно очищают и хроматографируют над S hadex G - 25 в воде. ПоЬле хроматографической очистки активный материал вновь осаждают из метанола с использованием эфира, выделяют, как указано выше, и получают 3 г антибиотической смеси.

Активные компоненты А и В разделяют противоточным распределением, используя 15 разделительных воронок (500 мл) с 250 мл каждой фазы и движущуюся нижнюю фазу. Верхней фазой является метилизобутилкетон: .1-бутанол (3:2), нижней0,1 М буферньш раствор фосфата натрия с рП 6,8., Компонент А перемещается с нижней фазой, компокзпт В остается в верхней фазе первой воронки. Выпаривание под вакуумом дает 0,1 г компонента В. Коашонент А извлекают из буферной фазы экстракцией с 1-бутанолом. Бутанольный экстракт вьшаривают досуха под вакуумом. Полученный таким образом остаток растворяют в метаноле и вновь иоюльзуют эфир для осаждения 2,9 г компонента А. Формулаизобретения Способ получения антибиотик, отличающийс я тем, что культуру Acti.nopianes utahenesis NRRL 5614 выращивают на ередг, схяоержиц источники углерода, азота и неорганические сопи, с последующим выделением и очисткой целевого про;0аста и разделением на активные компоненты иэтестными приемами.