Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты Советский патент 1974 года по МПК C07D99/14 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ

КИСЛОТЫ

та. Например, при использовании раствора бензилпенициллина сконцентрацией

100000 Е/мл калиевой соли бензилпенициллина по прошествии 12 час при рН 7,8 и при температуре наблюдают полный гидролиз до 6-аминопенициллановой кислоты и фенилуксусной кислоты, если на единицу пенициллинацилазы берут 10 единиц бензилпенициллина. Одну единицу фермента (Е) дефинируют как активность, которая при 37°С гидролизует в минуту 1 мкмоль бензилпенициллина. Если на единицу пенициллинацилазы берут 5X10 единиц бензилпенициллина, то полное расщепление продолжается 6 час. При более высоких концентрациях фермента возможно также более короткое протекание реакции. Соответственно расщепление продолжается тем дольше, чем меньще применяют фермента. Сроки расщепления более чем 20 час приводят, однако, вследствие разрушения пенициллина и/или 6-аминопенициллановой кислоты к уменьшению выхода.

Температура реакции ферментативного расщенления составляет иредпочтительно 38°С. При более низких температурах активность фермента уменьшается. Если расщепление проводят, например, при 25°С нужно применять количество фермента в два раза больше, чем при 38°С, для достижения одинаковой продолжительности реакции.

Активность нерастворимых, связанных носителем пенициллинацилаз заметно уменьшается в растворах с более высокой концентрацией субстрата. Расщепление раствора с 75000 Е/мл бензилпенициллина продолжается 12 час и с 150000 Е/мл 15 час, если изменяют только концентрацию, но не соотнощение фермента и бензилпенициллина. Предпочтительно применять раствор с 75000 - 100000 Е/мл бензилпенициллина.

6-Аминопенициллановая кислота может быть легко выделена при применении предлагаемого препарата фермента. Доля связанной носителем ненициллинацилазы в количестве 0,05 вес. % так незначительна, что на носителе едва может быть абсорбирована б-аминопенициллановая кислота. Связанная носителем пенициллинацилаза после расщепления может быть отделена центрифугированием или фильтрацией и многократно применена для дальнейшего расщепления.

Образовавшуюся при ферментативном расщеплении 6-аминопенициллановую кислоту получают в кристаллическом виде из реакционного раствора, который отделяют от нерастворимого фермента и затем концентрируют в вакууме посредством осаждения в изоэлектрической точке при значении рН 4,3.

Пример 1. Получение 6-аминопенициллановой кислоты (6-APS).

57 г влажной, связанной носителем пенициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) .и 160 калиевой соли бензилпенициллина вводят одно за другим в 2500 мл воды и размешивают при 38°С. Смесь поддерживают постоянно при значении рН 7,8, добавляя триэтиламин. По истечении 12 час не происходит больще поглощения триэтиламина.

Связанный носителем фермент отфильтроБывают, нромывают каждый раз 100 мл воды и 100 мл 0,2 М раствора поваренной соли и применяют снова для дальнейщего расщепления. Фильтрат, включая промывную воду, сгущают в вакууме до объема 300 мл и осаждают 6-аминопенициллановую кислоту в изоэлектрической точке при значении рН 4,3 в нрисутствии 500 мл метилизобутилкетона. По проществии 3 час при 5°С отфильтровывают и нромывают 200 мл воды и 200 мл ацетона. Продукт высущивают в вакууме при 40°С, т. нл. 208°С, выход 88,3% от теоретического.

Связанную носителем пенициллинацилазу последовательно, как описано выще, применяют десять раз для ферментативного расщепления бензилиенициллина. Получают выходы, приведенные в таблице.

Средний выход 87,2%.

Пример 2. ПО г влажной, связанной носителем ненициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) описанным в примере 1 образом размещивают с 160 г калиевой соли -

бензилненициллина в 2500 мл воды в течение 6 час при 38°С и при рН 7,8. Выход 6-аминопенициллановой кислоты составляет 89,5% от теоретического. Пример 3. 30 г влажной, связанной носителем пенициллинацилазы (удельная активность 0,044 Е/мг) описанным в примере 1 образом в течение 20 час при 38°С и рН 7,8 размещивают с 160 г калиевой соли бензилпенициллина в 2500 мл воды. Выход 6-аминопенициллановой кислоты составляет 86,1% от теоретического.

Предмет изобретения

1. Способ получения 6-аминопеницйллановой кислоты нутем ферментативного расщепления пенициллинов с использованием водонерастворимой пенициллинацилазы, фиксированной на носителе, отличающийся тем, что, с целью повышения качества и выхода целевого продукта, раствор пенициллина при рП 6-8 и температуре 20-50°С в течение 3-20 час приводят в контакт с суспензией пенициллинацилазы, ковалентно связанной с носителем в 5 виде смешанного полимеризата из акриламида, Ы,Ы-метиленбисакриламида и ангидрида малеиновой кислоты, затем смесь нейтрализуют органическими аминами и выделяют 6-аминоненициллановую кислоту известными спо-5 собами. 6 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве пенициллина применяют бензилпенициллин. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве органического амина используют триэтиламин.