Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты Советский патент 1977 года по МПК A61K31/43 C12D9/06 

гивностыо при получении 6-аминопенищллановоа кислоты.

Эти ферментные комплексы обладают низкой вязкостью, что позволяет легко выделять их ультрафилътранией из реакционной смеси.

Водорастворимые комплексы могут быть получены любым из известных методов присоединения ферментов к полимерам, например, присоединением деэцилазного фермента к полимеру (сочетание с полимером) путем использования таких реагентов, как галогенцианы (бромциан), 5-1риазинов (2 - амин - .4,6 -дихлор - S- триазин), азидов (2 - оксн - 3 - (п - диазофенил) - пропиловый эфир), органических цианатов (фенилцианат), а также диорганокарбодиимидов.

В некоторых случаях ферменты реагируют непосредственно с полимером, если в нем содержатся после модифицирования некоторые активные группы, такие как ангидридные связи, аминэтильные, оксизтильные или карбоксиметильные заместители.

Комплексы могут быть получень также связыванием фермента с водонерасгаоримым по.пимером, таким как декстран с поперечными связями в молекуле, а затем приданием образующемуся комплексу водорастворимости процессом разложеНИН, например частичным гидролизом или взаимодействием декстрана с поперечными связями с декстраназой.

Фермент способен присоетшняться к полимеру посредством мостиков, образованных, например, из диальдепадов, таких как глиоксоль или глицеральдегид и/шш диаминов, таких как 1,6-гексаметилендиамин или этилендиамин, и/или из a-w - аминоалифатической карбоновой кислоты, такой как глицин . или б-аминогексановая кислота.

Деавдлазяый фермент пенициллина можег быть присоединен к полимеру вшироких пределах соотношений полимер: фермент, например, 0,1 - 100:1, предпочтительным является соотношение полимер: протеин 2:1-20:1,

После получения в.одорастворимый комплекс ощщают перед ультрафильтрацией или хроматографией. Ультра фильтрационное оборудование имеет п6лупрош1цаемую оболочку (мембрану) с пределами исключения, обеспечивающими прохождение лишь низкомолекулярных веществ, но не высоко моле кулярных.

Предел исключения выбираю согласно молекулярному весу комплекса таким образом, чтобы гарантировать прохожде{ше 6-аминопенициллановой кислоты и задержку ферментполимерного комплекса, который регеиерируют для повторного использования.

Пример 1.5г фиколла мо;1екулярного веса 400000 растворяют в 165мл воды и доводят рН раствора с помощью 2 н. NaOH до 10. Залем к раствору добавляют 400 мг циаиогеибромида, перемешивают магнитной мешалкой, поддерживая температуру 20° С. рН поддерживают 11,0 добавлением 2 н. NROH. Через 20 мин после добавк(- дааногенбромида раствор доводят до рН 8,5 с помощью 2 н. HCI и смешивают со 170 мл водного раствора .ллиндеацилазы (560 мг протеина), обладающего такой активностью, которая позволяет получать 6,9 ммолей б-аминопенициллановой кислоты на 1 мг протеина в 1 мин при рН 7,8 и 37° С. Раствор перемешивают в течение ночи при 4° С, а затем концентрируют ультрафильтрацией через мембрану Эмикон ХМ-300, имеющую номинальный молекулярный вес 300000. Задержанное в ультрабильтрационной SPKKKS вещество, содержащее фиколл-пеницшшиновьш деаиялазный комплекс, промьгоают, уменьшают его объем до 44 мл, и продукт хранят при А С. Задержанное вещество обладает вязкостью, сходной с вязкостью нативиого фермента.

Активность фиколл-пенициллиндеацилазного комплекса сй1{жделлют следующим образом. Фосфатный буфер и бензилпенициллиновый раствор стабилизируют при 37°С до рН7,8 добавкой 0,1 н. NaOH. Для начала реакции добавляют 2 мл энзимного раствора, рН реакции поддерживают на уровне 7,8 добавлением 0,1 н. NaOH. Реакция протекает 20 мин, и каждую минуту проводят отсчет.

&о олл-пенициллиндеацилазнь1й ферментный комплекс удерживает 86,2% активности нативного фермента. Содержание протеина в комплексе устанавливают методом Лаури, Розенбру, Фэрр и Рэндалл. Общий выход сочетания 87,1%.

П р и м е р 2. Повторяют опыт по методике примера 1, но рН, при котором проходит сочетание деаиилазы пеиицил шна и активированного фиколла, равно не 8,5, а 10,0. Объем конечного продукта 40 мл. Общий выход сопряженного вещества на основе протеина, задержанного в продукте ультрафильтрации, составляет 78,5, ферментная активность 74,8%.

Пример 3. Методика аналогична примеру 1, но рН, при котором происходит сочетание между деацилазой пеницил.1шна и активироваршым фиколлом, равно 6,0. Объем конечного продукта 85 мл. Общий выход сопряженного вещества на основе протеина, задержанного в продукте ультрафильтрашш, 68%, Ферментная активность в задержанном продукте 56,7%.

Пример 4. Методика а }алогична примеру 1, по вместо фиколла используют декстран с молекулярным весом 250000. Объем конечного продукта 44 мл. Раствор (екстран-пенищ{лли1ювого деацилазного комплекса значительно более вязок, чем у деацилазного комплекса фиколл-пенициллина. Общий выход продукта сочетания на основе удержанного протеина 73,2%. Ферментная активность, задержаго)ая в деацилазном комплексе декстранпенициллина, 75,5%,

Пример 5. Исследование повторной применимости.

Раствор деацилазного комплекса фиколл-пенициллина, приготовле}шый по методике примера 1, добавляют к раствору 6,3 г калиевого бензилпени.циллина в воде и перемеилшают при 37° С.Величину рН реакционной смеси поддерживают на уровне 7,8 непрерывным введением 0,1 и. ISIaOH с использованием тритриметра. Реакция завершается через 4 ч, хотя продолжается 6 ч. Выход 6-аминопенициллановой кислоты 96,2% теоретического. Фермент отделяют от реагирующих веществ небольшого молекулярного веса ультрафильтрацией через мембрану с молекулярнь1М весом -5СЮОО. После промывки фермента в ультрафильтрационной ячейке дистиллированной водой ферментный полимер снова подвергают ультрафильтрации до тех пор, пока объем не понижается до 150мл. Задержанное вещество используют повторно для конверсии дальнейшей загрузки 6,3 г калиевого бензилпенициллина, который переводят в 6-амннопенициллановую кислоту эффективностью 96,5%. Весь цикл повторяют еще три раза, причем выход б-аминопенициллановой кислоты составляет соответственно 92,0, 96,0 и 91,0% от теоретических величин.

Пример 6. 18,5 мл деацилазного комплекса фиколл-пенициллина, приготовленного по методике примера 1, доводят йо 400 мл дистиллированной водой и перемешивают при 37°С и рН7,8. Добавляют 25 г калиевого бензилпенициллина, и рН поддерживают постоянным7,8 непрерывным введением Юн. NH4OH. Реакцию проводят 4ч. Фермент отделяют от реагирующих веществ малого молекулярного веса диализом против дистиллированной воды, используя диализер из полого волокна с диализирующим патроном с молекулярным весом 50000, фермент1П1Ш раствор концентрируют до 100 мл. Установку диализа промывают аликвотными количествами дистиллированной воды 2 «100 мл, а затем все смешивают с ферментным раствором и хранят при 4° С между каждым из экспериментов.

Семь последовательных экспериментов показали, что эффективность, с которой гидролизуется калиевый бензитшенициллин для образования 6-аминопенициплановой кислоты, составляет 93,2%, эффективность регенерации ферментов - 99,6%, из которых 2,5% теряется в пробах, взятых в течение каждого эксперимента. Перед каждым ог1ытом добавляют свежий фермент для компенсации любых потерь.

Пример 7. Проводят ферментный гидролиз калиевого бензилпенициллина с использованием

деацклазного комплекса фиколл-пенициллина по методу, описанному в примере 6. Реакцию проводят 4ч при рН7,8 и 37° С. Фермент отделяют от реагиРУЮ1ЦИХ веществ небольшого молекулярного веса следующим образом. Объем реакционной смеси снижают до 40 мл ультрафильтрацией через мембрану из полых волокон с молекулярным весом 50000. К концентрату добавляют 20 мл дистиллированной воды, и процесс концентрации повторяют. Наливают два аликвотных объема жидкости и уменьшают объем до 120 мл во вращающемся испарителе при 35° С. К концентрату добавляют равный объем метилизобутилкетона, и смесь сильно перемешивают в охлажденном металлическом сосуде. Когда температура падает до 4° С, медле(шо добавляют азотную кислоту до рН 43. В течение дальнейших 30 мин продолжают перемешиBaiffle. Вьшавшую в осадок 6-аминопенициллановую кислоту регенерируют фильтрацией, промывают метилизобутилкетоном, водой и ацетоном и высушивают в течение ночи при температуре 37° С.

Пример 8. Проводят ферментный гидролиз калиевого бензилпенициллина, как описано в примере 6, но при повышенной концентрации калиевого бензилпенидаллина (9% вес./об.), используя 27 г субстрата в реакцио нном объеме 300 мл, причем ферментная концентрация превышает вдвое ту, которая используется в примере 5. Реакцию проводят 4 ч при рН 7,8 и 37°С. Получают 6-аминопенициллановую кислоту с выходом 93,2%.

Формула изобретения

Способ получения б-аминопенициллановой кислоты путем ферментативного расщепления пени1шллина с использованием иммобилизованного фемента пенициллинам1щазь1 с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют водорастворимый комплекс фермента с сахарозе-эпигалогеновым сополимером и отделяют ферментный комплекс от реакционной смеси ультрафильтрацией.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Выложенная заявка Франции № 2019083, кл.С 12 D 13/00, 1970.