Способ получения водонерастворимого препарата фермента Советский патент 1976 года по МПК C07G7/02 

В качестве двухатомных или многоатомных спиртов по меньшей мере с двумя атомами углерода, предпочтительно с 2-12 атомами, используют: этиленгликоль, пропандиол-1,2, пропандиол-1,3, бутадиолы, в особенности бутандиол 1,4, гександиолы, декандиолы, глицерин, триметилолиропап, пентаэритрит, сорбит, sucrose и их продукты взаимодействия с алкилепоксидами. Используют также иолибисхлорметилоксациклобутан или полистиролоксид, смеси двухатомных и многоатомиых спиртов.

Предпочтительрю применяют диакрилаты или диметакрилаты двухатомных спиртов с 2-4 атомами углерода и/или продукты взаимодействия одного моля этих двухатомных спиртов с 1-20 молями алкиленоксида с 2- 4 атомами углерода или триметилолпропантриметакрилат, а также диметакрилаты этиленгликоля, диэтиленгликоля, триэтиленгликоля, тетраэтиленгликоля или высилих полнэтилеигликолей с молекулярными весами до 1000 или их смеси.

Наряду с применяемыми ди- и/или иолиметакрилатами добавляют также обычно применяемое средство сшивки по меньшей мере с 2-мя иекоитлогированными двойными связями, например, дивиниладииат, метилеибисакриламид, триакрилформаль или триаллилцианурат, в количествах ,01-30 вес. % но отношению к мономериой смеси.

Полимеризацию осуществляют в оргаиическом растворителе как осадительную, причем полимеры начинают осаждаться после иачала полимеризации. Пригодными являются все растворители, инертные по отношению к ангидридным группам. Оптимальные растворители - алифатические, циклоалифатические или ароматические углеводороды, а также галоидзамещенр1ые углеводороды, алкилароматические углеводороды или сложные эфиры карбоновых кислот. В качестве примеров следует назвать: гептан, октан, изооктан, бензиновые фракции с точками кипения от до 200°С, циклогексан, бензол, толуол, ксилол, хлорбензол, дихлорбеизолы, этилацетат, бутилацетат.

Растворители должны иметь точку кипеиия по меньшей мере 60°С и хорошо удаляться в вакууме из осажденного нолимеризата. Для одной части моиомериой смеси применяют примерно 2-50, предпочтительно 5-20 вес. ч. растворителя. На свойства сонолимеризата, особенно насыпной вес и удельную поверхность, значительно влияют род и количество растворителя.

В процессе полимеризации иепрерывно добавляют осадитель для полимера. Осадитель можио также добавлять в определенные моменты времени в одну или несколько порций. Моиомерную смесь вместе с пригодным инициатором в виде раствора или без растворителя можио поглошать в указанном количестве растворителя, так что во время полимеризации прямо получается равномерная мономерная концентрация. Путем применения метакриловых мономеров с различиой гидро-. фильностью и путем изменения условий полимеризации приготавливают продукты с приспособленной к цели применения набухаемостью, плотностью и удельной поверхностью при хорошей механической стабильности.

Сополимеризаты можно также приготавливать иутем сусиензионной нолимеризации.

Применяют вид бисерной полимеризации, при которой моиомеры, в известиых условиях, при добавке оргаиического растворителя суспепдируются в воде. Поэтому суспензионную полимеризацию целесообразно проводить в органической среде. Мономеры и инициатор растворяются в не смешиваемом с парафинами, инертном по отношению к ангидридным группам растворителе, как ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид или триамид гексаметилфосфорной кислоты, распределяются при добавке диспергаторов.

В качестве связующей фазы применяют парафиновые углеводороды, как гексаи, гептан, октан п высшие гомологи циклоалифатических углеводородов, как циклогексаи, а также смеси парафиновых углеводородов, как беизиновые фракции или иарафииовые масла. Объемное соотиошеиие связующая фаза : мономерная фаза составляет 1:1 -10:1, предпочтительно 2:1-5:1.

Для стабнлизации суспензин применяют глнцерин-моно- и диолеаты, а также смеси этих соединений, сорбитан моио- и триолеаты или стеараты, простой моиоэфир полиэтилеигликоля со стеариловым или лауриловым спиртом или ионилфенолом, сложный моноэфир полиэтиленгликоля с олеиновой, стеарииовой и другими кислотами жирного ряда с более чем 10 С-атомами, а также Na-соль

сложного диоктилового эфира сульфоянтариой кислоты. Эти вещества применяют в количествах, предпочтительно, 0,1 -10% по отношению к мономерной смеси, растворяют в углеводородной фазе. Величина частиц суспендированного полимеризата может уменьшаться за счет увеличения скорости перемешивания, путем добавки 0,1-2% по отношению к мономерам другого иоверхностно-активиого вещества, например алкилсульфоната.

Полимеризацию вызывают радикальными инициаторами. Пригодиыми инициаторами являются, например, азосоедннения или перекисные соединения. Пригодным азосоединеиием для возбуждения иолимеризации является нитрил азоизомасляиой кислоты. В качестве нерекисных соединений применяют диацилиерекиси, как перекись дибензоила или перкарбонаты, как диизопропил и дициклогексилперкарбонат, но можно также применять для инициирования диалкилперекиси, гидроперекиси и активные в органических растворителях окислительно-восстановительные системы. Инициаторы применяют в количествах

0,01 -10%, предпочтитетьно 0,1-3%, по отношению к общему количеству мономерной смеси. Полимеризацию осуществляют при температурах 20-200°С, предпочтительно 50- 100°С, в зависимости от скорости разложения инициаторов и ниже точки кипения растворителя, а при бисерной полимеризации - ниже температуры смещения обеих фаз. Полимеризовать можно в инертной атмосфере и в отсутствии кислорода. Сополимеризаты, полученные нутем осадительной полимеризации, от бесцветного до слабо-желтого цвета, порощкообразные вещества с насыпным объемом 1,5-30 иг/г, предпочтительно 2-20 мл/г, и удельными поверхностями 0,1-500 , предпочтительно 1- 400 . Содержание карбоксильных групп составляет 0,02-10 мэкв/г, предпочтительно 0,4-4 мэкв/г. Суспензионные полнмеризаты - белые или слабоокрашенные гранулы (бусинки), которые в некоторых случаях могут быть сформованы нерегулярно и имеют диаметр 0,03- 1 мм, предпочтительно 0,05-0,05 мм, и насыпные объемы 1,4-8 мл/г, предпочтительно 1,4-5 мл/г. Содержание в них карбоксильных грунп составляет 0,02-10 мэкв/г, предпочтительно 0,4-г-4 мэкв/г. Сонолимеризаты могут набухать в воде до своего 1,1-2,5-кратного насыпного объема. Они пригодны в качестве смол-носителей для фиксации веществ, которые могут реагировать с ангидридиыми группами сополимернзатов. Смолы-носители при температурах между О и 30°С вносят непосредственно в водный раствор вещества, который нужно связать, предпочтительно в водный раствор протеина, причем значение рН должно поддерживаться постоянным. Если протеины должны быть связаны с сополнмеризатами, то рН 3-10, предпочтительно от 5,5 до 9,0. Если в качестве протеина применяют пенициллинацилазу, то рН 5,7 и 6,8. Для поддержания рН добавляют основание (например, щелочи) и органические основания (например, третичные органические амины). Весовое отношение связанного вещества, например, протеина или пептида, к смоле-носителю может изменяться в широких границах. Высокий выход получают при соотношении: 1 вес. ч. протеина к 4-10 вес. ч. полимерного носителя. Оптимальные соотношения н структуры полимезависят как от состава ров, так и от рода протеина. В качестве стабилизаторов используют нолиэтиленгликолн или неионные смачиватели для ослабления денатурирования на поверхностях, а также известные 5П-реагенты или ионы металлов для специальных ферментов. Необходимое реакционное время зависит от рода полимера. Обычно реакция заканчивается через 20 час при комнатной температуре. При 4°С реакция протекает лучще, но медлен}1ее. Полимер со связанным протеином затем отсасывают и отделяют на центрифуге и остаток промывают растворами солей высокой ионной силы, например 1М раствором хлористого натрия, и затем буферным раствором, в котором фермент стабилен. При промывке растворами солей высокой концентрации от носителя отделяют ионогенно связанный протеин. Смолы-носители связывают все вещества, которые имеют функциональные групны, способные реагировать с ангидридными группами полимеров. Этими веществами являются прежде всего концевые аминогруппы лизина и свободные аминогруппы концов нептидных цепей. Пептиды и протеины, связанные с носителем, имеют больщое хозяйственное и техническое значение. Дорогостоящие и нестабильные ферменты значительно стабилизируются путем связывания со смолой. Легкая и полная регенерация ферментной смолы позволяет многократно применять ферменты в течение длительного периода времени. Расщепление пеницнллинов с помощью связанной с носителем пенициллинацилазы осуществляют в промышленном масштабе. Связанный с носителем нерастворимый фермент суспендируют в растворе 75000- 150000 Ш/ил пенициллина, нанример, пенициллина G или пенициллина V. Ферментное расщепление проводят при постоянном значении рН 6-9, оптимальное значение рН 7,8. Для нейтрализации отщепленного ацильного остатка, например, фенилуксусной кислоты или феноксиуксусной кислоты прпменяют водные растворы щелочей, например, раствор едкого кали или раствор едкого натра, или оргаиические амины, предпочтительно триэтиламин. По расходу (потреблению) основания можно судить о скорости реакции и окончаиии расшепления. Пенициллинацилаза катализирует как расщепление пенициллина до 6-APS, так и синтез пенициллина вновь из нродуктов расщепления. Равновесие зависит от значения рН среды, При меньших значениях рН равновесие сдвигается в пользу исходного продукта пенициллина. Это можно иснользовать для переацилнрования пенициллинов в присутствии других ацильных остатков или для синтеза пенициллинов из Q-APS. Реакционная температура ферментного расширения составляет предпочтительно 38°С, При более низких температурах активность фермента падает. Если расщепление осуществляют, например, при 25°С, то применяют вдвое больще фермента, чем при 380°С, ирг одинаковом времени реакции. Скорость реакции при указанной температуре зависит от специфической активиости i количества связанной с носителем пен1щнл линацнлазы. Кроме того, скорость реакши зависит от отношения количества связанной носителем пенициллинацилазы к концентра дни пенициллина. Исходная смесь для расщепления с концентрацией калиевой соли пенициллина G 100000 Ш/мг (1 мг калиевой соли пенициллина G соответствует 1598 Ш (международные единицы) спустя 10 час ири рН 7,8 и 38°С полностью гидролизуется до 6-APS и феиилуксусной кислоты, если на единицу пеиициллинацилазы применяются 3-10 едиииц пеиициллииа G ферментная единица U-определяется как активность, которая гидролизует 1 111моль 6-нитро-З-(фенилацетил)-амииобензойной кислоты (НФАК) в минуту при 25°С. Доля сухой ферментной смолы составляет только 0,5-1% реакцион.ной смеси. Если на Ю lU пенициллииа G применяют 2 едииицы пеиициллииацилазы, то полное расщепление длится только два часа. Возможны и более короткие промежутки времени реакции, если применяют еще более связаиные иеиициллинацилазы (при применеНИИ, например, связанной с носителем пенициллинацилазы из кристаллического фермента). Связанная с носителем иенициллииацилаза может быть гранулообразиой и отличаться высокой механической стабильиостью и сравнительно высоким удельным весом. Эти свойства ири многократном введении делают возможным примеиение ее в течение длительных иериодов времеии. Приготовленная связанная с носителем пенициллииацилаза позволяет осуществлять быстрое и одиократиое фильтрование, так как благодаря механической стабильности не возникают никакие микрочастицы, засоряющие иоверхиость фильтра. Преимущества дает смола в Batch-процессе из-за сравнительно высокого удельного веса, который обусловливает быстрое отстаивание смолы, так что ио окончании процесса иаходящийся иад ией раствор можно легко сливать. Свойства иолимеризата делают возможны. применение связанной с носителем пенициллинацилазы ие только в Batch-процессах, ио и в неирерывных способах, например, в реакционных колоннах, бисерная форма дает высокую скорость протекания процесса. Пример I. 80 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 20 г ангндрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты растворяют в 1 л бензола и нагревают при перемешиваиии в течение 4 час при 60°С. Затем добавляют 1 г нитрила азоизомасляной кислоты и 200 мл бензина (т. кип. 100-140°С) и полимеризуют 5 час ири 70°С. Порошкообразный иолимер отсасывают, суспендируют (взмучивают) один раз в бензоле и три раза в иетролейиом эфире (т. кип. 30-50°С) и высушивают в вакууме. Выход 94 г. Насыпной объем 3,5 мл/г, объем иабухания в воде 4,7 мл/г, удельная поверхность 5 . Содержание кислоты иосле омылеиия аигидридиых 3,5 мэкв/г. П ри М ер 2. 1 г приготовленной соглпгио примеру I смолы-носителя суспендируют в 0 мл водного раствора иенициллииацилазыс дельной активностью 132 Ш/мт протеина иурет. При постоянном рН 6,3 путем добавения 1н. раствора едкого иатра с устаиовенным pjH-зиаченнем суспензию перемешиают 20 час при 25°С. Затем отсасывают чеез стеклянную фритту (фильтр) G 3 и ироывают смолу 50 мл 0,05 М фосфатиого буера с рН 7,5, который содержит 1М хлоритого натрия, и тем же буфером без хлоритого натрия. Путем дальнейшего промываия активиость смолы ие изменяется. Ферментные (энзиматические) активиости (НФАК-тест), и (I едииица U соответствует ревращению 1 ммоль субстрата в минуту): Исходный раствор Раствор, находящийся иад осадком, -f промывиая вода Смола-носитель после преврачто соответствует 65% исходной активности,. Ферментную активность иеиициллинацилазы измеряют колориметрически и путем титрования при иомощи 0,002 М 6-иитро-3-(Мфеннлацетил) - амииобензойнойкислоты (НФАК) в качестве субстрата нри рН 7,5 и 25°С. Молярный коэффициент экстинкции Е образующейся 6-иитро-З-аминобензойной кислоты составляет 9090 ири К 405 им. П р и М ер 3. Раствор 90 г этилеигликольдиметакрилата, 10 г ангидрида малеииовой кислоты и 1 г иитрила азоизомасляной кислоты в 1 л бензола полимеризуют при перемегииваннн сначала при 60°С. Спустя 4 час добавляют 200 мл бензина (т. кип. 100140°С) и 1 г нитрила азонзомасляиой кислоты и полимериз5 ют далее 2 час при 70°С и 2 час ири 80°С. Затем нолимер отсасывают, промывают иетролейным эфиром (т. кии. 30- 50°С) и высушивают в вакууме. Выход 97 г. Насыпной объем 6,4 мл/г, объем при набухании в воде 8,0 мл/г, удельнановерхиость 298 . Содержание кислоты после омыления аи гидпндных групп 1,5 мэкв/г. П р и мер 4. 6 г полученной согласно при меру 3 смолы-носителя вводят во взаимодей ствие, аналогично иримеру 1, с 590 U пеин циллинацилазы в 165 мл воды. Ферментные активиости (НФАК-тест), U: Исходный раствор590 Раствор, находящийся под осадком, + промывная вода26 Смола-носитель после превращения 352, что соответствует 60% исходной активиости. Пример 5. Соиолимеризация 90 г диэтиленгликольди.метакрилата с 10 г ангидрида маленновой кислоты при условиях примера 3 дает выход 96 г, насыпной объем 5,5 мл/г, объем при набухании в воде 6,7 мл/г, удельную umepximcTb 9,2 . Со.юржаиио кислоты иосле омыления ангидридных грзпп 1,9 мэкв/г. П р и М ер 6. I г приготовленной согласно примеру 3 смолы-носителя добавляют к раствору 50 мг неспецифической эластазы с ферментной активностью 139 /7 в 32 мл воды. Композицию перемешивают 16 час при комнатиой температуре, рН поддерживают постоянным 5,8. После превраш,ения смолу отсасывают и промывают 50 мл 1н. раствора хлористого натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и затем 50 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 7,5.

Ферментная активность, Е (одна единица Е соответствует расходу 1 ммоль раствора едкого кали в минуту):

Исходный раствор139

Раствор, находящийся над осадком,+промывпые растворы51

Эластаза, связанная со смолойносителем15, что соответствует 11 % исходной активности.

Ферментную активность определяют титрованием при помощи казеина в качестве субстрата (концентрация 11,9 мг/л) при рН 8,0 и 25°С.

П ри Мер 7. 1 г приготовленной согласно примеру 5 смолы-носителя добавляют к раствору 50 мг кристаллической уреазы (Merck) в 32 мл воды. Композицию перемещиваютпри комнатной температуре 16 час при постоянном рН 6,3. Переработку осуществляют как указано в примере 3.

Ферментная активность уреазы, U (одна единица И соответствует количеству фермента, которое расщепляет 1 ммоль мочевины в минуту):

Исходный раствор5013

Раствор, находящийся иад осадком, + промывные растворы1397

Смола-носитель после превращения 1405, что соответствует 28% исходной активности.

Фермеитную активность уреазы определяют титрованием с помощью 0,17 М раствора мочевипы в качестве субстрата при 25°С и рН 6,1.

Пример 8. 0,4 г полученной согласно примеру 5 смолы-носителя добавляют к 40 мг глютатиопа в 32 мл воды 16 час при постоянном значении рН 6,3 и комнатной температуре. Смолу отсасывают, промывают 1н. раствором хлористого натрия в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и затем водой, высушивают в вакууме при 100°С над пятиокисью фосфора и получают 0,47 г сухой смолы. Определение азота по Дюма дает значение 1,1%, которое соответствует содержанию 8,04% или 37,8 мг глютатиона. Это соответствует 94% введе1гного количества глютатиона.

Пример 9. 80 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 20 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г порофора N растворяют в 1 л бензола и при медленном перемешивании полимеризуют 16 час при 80°С.

Полимер обрабатывают аналогично примеру 1.

Выход 95 г, насыпной объем 2,5 мл/г, объем набухания 3,0 мл/г.

Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 2,6 мэкв/г.

Пример 10. Взаимодействие 1 г приготовленной согласио примеру 9 смолы-носителя с пенициллинацилазой аналогично примеру 2 дает следующие результаты:

Ферментные активности (ПФАК-тест), U: Исходный раствор123

Раствор, находящийся над осадком, + промывные растворы13

Смола-носитель после превращения79, что соответствует 64% исходной активности. Пример 11. В аппарате с мещалкой нагревают 1 л бензина (т. кип. 100-140°С) и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в течение 1 час при 90°С. Затем при 80°С прикапывают раствор 95 г этиленгликольдиметакрилата, 5 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в течение Зчас и перемещивают 2 час при той же температуре.

Полимер отсасывают несколько раз, промывают бензолом и петролейным эфиром (т. кип. 30--50°С) и высущивают в вакууме.

Выход 96 г, насыпной объем 14 мл/г, объем при набухании в воде 18,2 мл/г, удельная поверхиость 70 .

Содержание кислоты после омыления апгидридных групп 0,5 мэкв/г.

Прпмер 12. 0,4 г приготовленной согласно примеру 11 смолы перемещивают с 40 мг глютатиона в 32 мл воды 16 час при постоянном рН 6,3 и комнатной температуре. Смолу отсасывают, промывают и высущивают согласно примеру 8. Получают 0,46 г смолы, которая содержит 0,9% азота по Дюма. Этому соответствует содержание 6,6% или 30,4 мг глютатиона, которое равио 70% от введенного количества.

Пример 13. Раствор 62,5 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 37,5 г ангидрида малеииовой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в 150 мл бутилацетата и 1 л бензина (т. кип. 100-140°С) полимеризуют при перемещивании 2 час при 70°С, 2 час при 75°С и 1,5 часири 90°С.

Полимер отсасывают, экстрагируют бензолом 24 час в экстракторе Сокслета и высушивают в вакууме.

Выход 77 г, насыпной объем 7,3 мл/г, объем при набухании в воде 8,2 мл/г, удельная поверхность 19,4 .

Содержание кпслоты после омыления аигидридных грунп 4 мэкв/г.

Пример 14. Раствор 90 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 10 г ангидрида малеииовой кислоты и 1,0 г иитрила азоизомасляной кислоты в 200 мл ацетонитрила суспендируют в 100 мл бензина (т. кип. 100-140°С), в котором растворяют 5 г смеси глицерин-моно- i диолеата. Реакционную смесь полимеризуют вилоть до образования твердых частиц (гра иул) час ири 60°С, а затем 20 час npi 65°С. Полимеризат отфильтровывают, три ра

11

за взмучивают в бензоле н три раза в петролейном эфире (т. кнп. 30-50°С) и высушивают в вакууме.

Выход 94 г, средний диаметр частиц 0,35 мм, насыпной объем 2,8 мл/г, объем нрн иабуханнн в воде 3,1 мл/г, удельная поверхность 3,4 .

Содержание кислоты носле омыления аигндридных групп 1,5 мэкв/г.

Пример 15. 79 г влажной, связанной с носителем пенициллинацелазы с активностью 687 и, которую получают путем связывания пеннциллинацилазы с сополимеризатом из этиленгликольдиметакрилата и ангидрида малеиновой кислоты, согласно примеру 3, перемешивают со 129 г калиевой соли пенициллииа G (чистота 98%) в 2000 мл воды 9 час при 38°С, рН иоддерживают постоянным 7,8 путем иеирерывиой добавки триэтиламина. Поглон1ение триэтиламина прекраш;ают с окончанием реакции. Связанную с носителем пеиициллинацилазу отделяют путем центрифугирования нли отсасывают, промывают последовательно 200 мл воды и 0,2 М фосфатным буфером с рН 6,5. Фильтрат, включая промывные растворы, сгуидают в вакууме до 300 мл 6-ЛЯ5, осаждают путем добавки полукоицеитрированной соляной кислоты с изоэлектрической точкой при рН 4,3 в присутствии 200 мл метилизобутилкетона. Спустя час отсасывают, промывают 200 мл воды и потом 200 мл ацетона. Q-APS высушивают в вакуу12

ме при 40°С, точка плавления 208°С. Выход в расчете на Q-APS составляет 67,8 г, что соответствует 90,5%. Чистота 98%.

Пример 16. 60 г влажной связанной с носителем пенициллинацилазы с активностью 673 и (НФАК-тест), которую получают путем связывания пенициллинацилазы с сополимеризатом из тетраэтилеигликольдиметакрилата и ангидрида малеиновой кислоты согласно примеру 1, перемешивают с 129 г калиевой соли пенициллина G в 2000 мл воды 9 час при 38°С. Значение рН поддерживают 7,8 путем добавки триэтиламина. Дальнейшую обработку осуществляют аналогично примеру 15. Выход б-ЛЯ составляет 65,3 г, что соответствует 87%.

Формула изобретения

Способ получения водонерастворимого препарата фермента с полимерным носителем, отличаюш,ийся тем, что, с целью получения стабильного препарата пенициллииацилазы, фермент подвергают контакту с сополимером а, р-моноолефиноненасыщенного ангидрида дикарбоновой кислоты с 4-9 атомами углерода и ди- и/или иолиметакрилата дии/или пол иолов при рН 5,7-6,8 i температуре О-30°С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Франции № 2019083, кл. С 12D 13/00, 1970 (прототип).