ВПТБ Советский патент 1973 года по МПК C12P37/00 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОАЛЛЕРГЕННОГО ПЕНИЦИЛЛИНА

Изобретенйе .оится к области медицины, точнее к пролз во детву антибиотиков. Известен способ получения гипоаллергенного пенициллина, заключающийся в там, что бенз илп-енициллин .подвергают гидролизу ферменто.м, выделен;ньг1М из Е. СоИ, образовавшуюся 6-ам.инО:Пвницнллановую кислоту освобождают от белков-аллергенов путам диализа или ге.тьфильтрацИИ и превращают в .целевой продукт известным путем. Цель изобретения - упрощение процесса. Это достигается тем, что гидролиз осуществляют гилоаллергенньш -ферментом, выделенным из клеток, разрущенных продавливанием через мембрану шириной 0,1 - 1,5 мм в течение 0,05-1,0 сек под давлением 34-136 атм. Пример I. Получение клетОК бактериальной культуры. Питательную среду, имеющую следующий состав: кд куруаный экстра,кт 3 кг, соевое масло 135 мл, парафин-парафин 12 мл, цетанол 3 мл, вода 150 л, рН - 6,0, стерилизуют при 124° С в течение 30 мин, засевают 100 мл 20-24 час культуры Е. СоИ (Astra 1339) и инкубируют Ц:ри 25° С с продуванием и леремещиванием в течение 18 час. Затем полученной культуральной жидкостью засевают ферментер с иосешюй средой, и.меющей следующий состав: кукурузный экстракт 300 кг, соевое масло 13,8 кг, парафин 1,22 кг, цета.нол 0,3 кг, фенилуксуоная кислота 2,1 кг, хлористый натрий 112 кг, вода 14000 л, рН 6,6. Через 24 час после инкубации при 25° С с перемешиванием и лродуванием воздуха, когда рН увеличивается до 8,2, бактериаль}гые клетки убивают луте,м добавления бутилацетата (180 л) и смесь после этого о хлаждают. (Пример 2. Выделение и очистка ацилазы. Отделение питательной среды и л.родавллвание |Клеточного вещества проводят одновременно в самоочищающемся центробежно м сепар.аторе, работающем при О-50°С, в которо.м отделенное клеточное вещество продавливается в пульсирующем цикле за время 0,05-1,0 сек через мембрану со щелью шириной 0,1-1,5 мм под давлением 500-2000 фунт/дюйм.) Пасту бактериальных клеток сооирают в иорцип по 100 кг, к .каждой из которых прибавляют 3,0% метилизобутилкетон, и смесь годюгенизируют с помощью мещалки в течение 25 мин. Общий выход бактериальной массы Э25 кг. Полученную ласту бактериальных клето:ч используют в экспериментах по изучению со) фунт1дю1ЬР 0,070307 кгс;с.м.

любилизацйи энЗИ.ма (к 100 г клеточной пасты добавляют 100 мл де.ио«Изи,рОван«ой воды).

Полученную суспензию обрабатывают, например, следующим о.бразОМ.

Суспензию гомогенйЗИруют с помощью мешалки в течение 5 мин, образец охлаждают в бане со ль;до;М, чтобы температура о-бразца .не подни малась выше 35° С. Затем образец центрифугируют ври 5000 G (цент;раб€жная села, выраж&ЕНЗЯ через ускорение силы тяжести) в течение 20 мин и определяют активность энзима в поверхностном слое.

Гомогенизированную бактериальную пасту (175 кг, аитнвность 190 ед/г) разбавляют водой (175 кг « при перемешивании смеси додо|бавляют Hyflo (22,7 кг), Celite505 (22,7 тег), Fibraflo -(10,2 кг). Водную фазу отделяют путем фильтрования через фильтр Funda и остаток на фильтре промывают водой (50 л). Соединенные растворы (290 кг имеют активность 48 ед/г.

,Го,могенизированную бактериальную пасту (I кг, активность 212 ед/г) разбавляют водой (2,0 л), устанавливают рН 8,5 путем добавлениЯ 0,5 N раствор NaOH (220 мл и затеэд пере.мешйвают при 20°С в течение 30 мин. Омесь центрифугируют ири 13200 G в течение 30 мин при 0°С. Далее декантируют поверхностный слой жидкости, осветляют его фильтрование-м и получают 2,7 кг раствора с ахтивностью 50 ед/г. Ловторное суопензирова}ше осадка от центрифугирОвания в воде (1 л} дважды в течение 5 мин лри рН 8,5 с лоследующим центрифугированием, давало дополнительное количество раствора энзима (2 кг, активность 11 ед/г). Это соответствует обш,ел1у выходу водораст&орймой ацилазы, р авному 74%.

Из полученного прозрачного раствора ацилазы (2 кг, активность 50 ед/г) методом лиофильной сушки получают 98,5 г твердой ац.члазы с активностью 950 ед/г.

Гомогенизированную бактериальную пасту (1 кг, активность 128 ед/г) центрифугируют при 13200 G в течение 30 мин при 0°С. Затем декантируют поверхностный слой жидкости (500 г, активность 80 ед/г), осветляют фильтрованием и используют для энзи.матического расщеплеиия пеницилди1иа с получением 6аминопеницилл.инсвой кислоты.

ПрИмер Э. Получение 6-аминояенициллиновой кислоты.

К раствору энзима (283 г, активность 42 ед/г) прибавляют раствор калиевой соли бензллпенициллйна (20 г) в воде (317 мл).

Смесь выдерживают в тер.мостате при 37°С, рН .поддерживают на уровне 7,8, периодически добавляя 2,5 N раствор NaOH. Через 6 час реакционную смесь, содержащую 10,7 г 6-а,минопени:Ц.илллновой кислоты (92 %), фильтруют.

Раствор подкисляют до р.Н 3 5N соляной кислотой и экстрагируют половинным объемом метилизобутилкетона для удаления остатков бензилпенициллина и фепилуксусаой

ислоты, которая входит в молекулу в виде бокового ответвления и отщепляется в процессе образования б-аминопенициллиновой кислоты. После экстрагирования водный раствор отделяют от Метйлизобутилкетона. рП водного раствора устанавливают равны.м 7,5, упаривают в вакууме до объема 120 мл, охлаждают до 5°С и фильтруют. При под кислении фильтрованого раствора 5N соляной кислотой до рН 4,3 осаждают кристалличес кую 6-а;минопенициллнновую .кислоту.

После отфильтровывания кристаллы промывают слегка охлажденной водой, затем ацетоном и высушивают в вакууме с лолучепнем 8,84 г б-аминоленищиллиповой кислоты. П р И- м е р 4. ПолучеНИе паранятробензилового эфира б-а.минопенициллиновой кислоты.

Раствор энзима (18,6 г, активность 1610 ед/г) разбавляют водой (700 мл) и .метанолом (120 мл), устанавливают рН 7,8, добавляя 0,1 N раствор NaOn и .прибавляют раствор иНИтробензилбензилпенициллината (Э,1 г, 6,6 моль) IB метаноле (60 мл).

Смесь перемешивают при 37°С « поддерживают рН 7,8, 0,4 N раствор NaOH. Через 2,5 час смесь охлаждают и экстрагируют этила.цетатом (500 мл). Кислый слой отделяют и экстрагируют даполнительной порцией этилацетата (250 мл), оргавические слои соединяют вместе и высушивают безводНЫМ сульфатом натрия в течение 1 час. После фильтрования органический piacTBop разделяют на 2 равные части. О.дну часть упаривают в вакууме при комнатной температуре и получают свободный л-йитробензиловый эфир 6-аМНпопенициллиновой кислоты в виде маслонодобного осадка. К другой части раствора в этилацетате .прибавляют бензолсульфоновую кислоту (0,58 г), раство.ренную в ацетоне (20 мл и упаривают полученную смесь в вакууме до объема 30 мл.

После добавления серного эфира (10 мл и выдерживания смеси в течение почи на льду осаждается бензолсульфоново-кислая соль «- 1итробензил - 6-ами1нопенициллината (0,8 г) в виде белый .кристаллов с т. пл. 148-15PC. Пример 5. Энзиматический синтез бензилненидиллина.

б-амипопенициллпновую кислоту (175 мг) и фенилуксусную кислоту (111 мг) растворяют в буфернол растворе фосфата калия (0 мл при рН 7,0) и к полученному раствору добавляют растворенную в воде ац.илазу. Устанавливают рН на уровне 5,0 с помоп ыо 1 М раствора НзРО4 и выдерживают в термостате .при 37°С. Через 4 час раствор охлаждают и анализируют методом бумажной хроматогра ф ил. 30% 6-аМ.иноленицилли|Новой кислоты превращаются в беизил.пенициллин.

П р е .д м е т и з о б р е т еп и я

Способ получения гиноаллергенного пеиициллшга путем ферментативного гидролиза

бепзилпенпциллин.а ферментом из клеток 5 Е. Coli до б-аминопенициллановой кислоты с последующлм ее превращением в целевой продукт известным oiyTeM, отличающийся тем, что, с .целью упрощения .процесса, гадролиз осуществляют гилоаллергенным ферментом,5 6 выделенным лз клеток, .разрушенных лродавливакием чарез мембрану со щелью щириной 0,1-1,5 мм в течение 0,05-1,0 сек под давлением 34-136 атм.