Способ получения ковалентно связанной с носителем пенициллинацилазы Советский патент 1974 года по МПК C07G7/02 

Изобретение относился к способу получения нерастворимой в воде пенициллинацилаэы, ковалентно связанной с носителем в виде слабо сшитого смешанного полимеризата акриламида, малеиновой кислоты, и 1(,Н-метиленбисакриламида. Изобретение мохет найти применение для ферментативного получения 6-аминопенициллановой кислоты из пенициллинов.

Известно применение для получения 6-аминопенициллановой кислоты пенициллиназы, фиксированной на носителе в виде линейного полимера ,ангидрида этиленмалеиновой кислоты ТЕМА - смола). Этот полимер является, однако, очень неоднородным и после гидролиза группы ангидрида карбоновой кислоты при нейтральном или щелочном значении рН растворим в воде. Этот полииер только в результате связи с ферментом и другими, связанными как сомономеры в нескольких местах ди-или полиаминами образует поперечные связи и вследствие этого становится растворимым в воде. Низкомолекулярные и частично растворимые в воде фракции не могут быть разделены. Поэтому связанный протеин теряется как растворимый материал. Кроме того ЕМА - смола вследствие более высоких концентраций протеина образует так сильно поперечные связи, что она оказывается лишь частично доступной для субстрата.

Предлохен способ получения нового нерастворимого в воде фермента, фиксированного на носителе посредством образования с ним ковалентных связей: пенициллинацилааы, ковалентно связанной с полимеризатом акриламида, малеиновой кислоты и Ч,м-метиленбисак иламида,

Способ заключается в том, что смешанный полимеризат из акриламиа, малеиновой кислоты и N,N-мети ленбисакриламида нагревают в вакууме и полученный ангидрид течение нескольких часов при емпературе нихе 20 С и при знаении рН 0,0-6,5 вводят в реакцию водным раствором пенициллинаилазы.

При этом аминогруппы фермента реагируют с ангидридными группами полимеризата, причем до 98% пенициллинацилазы связывается ковалентно с носителем и активность фермента, вводамого во взаимодействие с полимером - носителем, полностью сохраняется.

Получение смешанного полимеризата осуществляют известными методами. После смешанной полимеризации желеобразную смолу продавливают через сито с отверстиями 0,5 мм, хорошо промывают и высушивают в вакууме. Лолимеризованную дикарбоновую кислоту посредством двухчасового нагревания до 180 С переводят в ангидрид дикарбоновой кислоты. Больше 2 ч нагрев лродолхать не следует, так как затем явно уменьшается способность смешанного полимеризата образовывать связи.

Способность связи протешш смешанного полимеризата зависит от числа присутствующих ангидридных групп и от величины пор. При узко сшитом пр-одукте спосрбно сть к связи меныве, чем при менее узко сшитых полимерах. Вследствие меньшего образов,ания поперечных связей увеличивается способность набухания полим-еризата, причем одновременно уменьдается прочность на истирание.

Для ковалвнтной связи пенициллинацилазы изготовляют предпочтительно пол-имеризат из 45 ч акрил-амида, . 3 ч. NJN-мeтилeш5иcaкpилa:мида и 15 ч малаиновой кислоты. Аминогруппы пенициллинацилазы с ангидфидннми групп,ами полимеризата при рН 5,0 - 6,5, предпочтительно при рЙ 5,8. Так как вследствие сольволиза циклических ангидридных групп возникает слабокислый катионит, значение рН реакционной смеси медленно понижается, если в реакционную смесь непрерывно не добавляют разбавленный раствор едкой щелочи. Целесообразно применять регулятор

значения рН. Специальные условия еакдаи имеют большое значение ля выхода связанной пенициллинаилазы. Выход зависит полностью т рН, Так например при рН 5,8

н равен Ж. пси пН 6.5 - 45 и при рН - 4,5 - только 22%.

Температура реакции также меет большое значение. Она должна быть возможно ниже. При более высоких температурах гидролиз циклических ангидридных групп протекает скорее, чем аммонолиа. Предпочтительно работаю при -+-4.

Вза.имодействие зависит, кроме того от ионной силЫ| его проводят предпочтительно в буферном раствоЕе с незначительной ионной силой. ри высоких буферш1х концентр.ациях полимеризат сжимается, так что фермент медленнее проникает в матрицу полимера и мржет медленнее реагировать. Предпочтительно примедять О,01-0,05 моль фосфатного буфера. После взаимодейстия отфильтровывают пенициллинацилаэу на носителе и интенсивно промывают водоД с 1 М раствором повдренной С.ОЛИ.

На 1 г фермента пр-ш,шяют ,по меньшей м&ре 10 г сме.шанво.го полимэризата. И.з этой смеси при-близиг тельно Зг-4 г прцба. в раствор ферменра в 250 мл О,Ш М фо.сМтного буфера при -вначении рН 6,5 инте-нС-иВНО -размеЕИва т ипо истечении 2 ч .ля;ю-т маленьдими дозами остал-ьной .смеш.анный полимериват. &1.ачение .рН в течение всей ре-анщи подде рживают постоянный посредсожом добавления- раабавленного раствора едкого натра. Если по прошествии

0Ч отСТОЯвши-йся верхний в-одный слой содерхи-т, евде не прореагировавший знзим, добавляют еще смешанный полимери-зат. Соотнатени«

1ч энйима к 15-20 ч смешанного пол-ьшери-зата является обычно достаточным для полной реакции обменного разложения.

Пенициллина илазу на носителе можно Х1 анить &ез потерь ферментной эффективности.

Для определения ферментной . активности пенициллинацилазы на носителе инкубируют раствор 30 000 М. Ел/мл бензилпеницилинакалия при . Освобожденную, фенилуксусную кислоту при постоянно поддерживаемом значении рН 7,8