Способ получения нуклеазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/22 

(S) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ S-, Изобретение относится к способам получения нуклеазы ЕС 3w 1..21}одноцепочной нуклеат-5-олигонуклеотйд гидролазы, применяемой в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты и строения рибосомальной, транспортной и вирусной рибонуклеиновой кислоты, в генетической инжене рии для получения рекомбинатных моле кул и при получении 5-рибо- и 5-деэоксирибонуклеотидов из рибонуклеиновой кислоты и денатурированной дезок .сирибонуклеиновой кислоты. Известен, способ получения нуклеазы S,, из амилоризина путем термообработки при , высаливания сульфатом аммония (70-100% степень насыщения), диализа и хроматографии на сульфосефадексе СП-50 при рН и на сефадексе G-75. Достигаемый вы ход нуклеазы при удельной активности 50 ед/мг til. . Однако способ имеет недостаточную высокую активность фермента, необходимость двукратной хроматографии, осложняющей процесс. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения нуклеазы 3, включающий экстрагирование такадиастазы, осаждение сульфатом аммония до насыщения 60-ЭО% диализ, хроматографию на диэтиламино-. этилцеллюлозе, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0 ступенчатое элюирование, при этом использует 0,01 М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,05 М натрия хлористый в 0,01 М фосфатном буфере, 0,02 М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,01 М натрий хлористый в 0,01 М фосфатном буфере 0,0« М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,2 М натрий хлористый и 0,01 М фосфатном буфере, 0,04 М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,5 М натрий хлооис399тый в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0. Нуклеаза S элюируется О,О М калием фосфорнокислым однозамещенным и 0,2 М.натрием хлористым в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0, после чего про водят гёльхроматографию на сефадексе G-75. Получают препарат нуклеазы S-,: активность 18425 ед/мг белка, выход 3%, степень очистки 10000 раз С2 . Однако известный способ имеет сравнительно низкое качество полученного препарата (имеются примеси рибонукле33 Т и Т2 , фосфодиэстераз, ферментов, расщепляющих нативную дезоксири бонуклеиновую.кислоту). Сложность пр цесса - повторная очистка препарата .гельхроматографией на сефадексе G-75 Целью изобретения является повыше ние активности и качества нуклеазы 5 (под повышением качества понимают отсутствие примесей сопутствующих ферментов). Поставленная цель достигается спо собом получения нуклеазы S на основе продуцента Aspetgillus oryzae, вклйчающим фракционированное осаждение белков сульфатом аммония и выделение нуклеазы S хроматографией на дизтиламиноэтил-целлюлозе, причем в качестве источника нуклеазы 5 используют культуральную жидкость. Aspergillus oryzae , полученну при культивировании на питательной среде, обогащенной сульфатом цинка в количестве 0,05-0,07 весД, фракционированное осаждение осуществляют при степени насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония 0,65-0,95, а. хроматографию проводят при рН 5,0-5,5 в среде ацетата аммония, содержащего 0,1-1 мМ ионов цинка , с элюцией линейным градиентом указанного раствора ацетата аммония в пределах концентраций 0,020,5 М. Способ осуществляют следующим образом. Культуральную жидкостьAsp. огуzae, выращенную на известной- питательной среде З 1 обогащенной сернокислым цинком, и обладающую нукле азной активностью, подкисляют до рН 24 5,7 и добавляют сульфат аммония до 0,65-0,95 насыщения, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в растворе ацетата аммония рН 5,05,5, содержащего ионы цинка, диализуют и наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешенную раствором ацетата аммония рН 5,0-5,5, содержащим ионы цинка, Элюцию проводят линейным градиентом ацетата аммония от 0,02 до 0,5 М. Фракции, содержащие нуклеазу S объединяют. Полученная нуклеаза .5 является гомогенным белком при электрофорезе в полиакриламидном геле и не содержит примесей ДРУГих ферментов, расщепляющих рибонуклеиновую кислоту и нативную дезоксирибонуклеиновую кислоту. Пример . Культуральную жидкость Asp. oryzae 3-9-15 (500мл), вы-, раженную на питательной среде, содержащей ионы цинка с нуклеазной активностью 220 ед/мл подкисляют до рН 5,7 и добавляют сульфат аммония до насыщения б5, центрифугируют kO мин при 500 об/мин. К центрифу- . ГУ добавляют сульфат аммония до насыщения 951 и оставляют на 1520 ч. Раствор центрифугируют 1ч при 5000 об/мин и полученный осадок растворяют в О,02 М растворе, ацетата аммония, содержащего 0,1 М ионов цинка и диализируют против 0,02 М раствора ацетата аммония, содержащего 0,1 М ионов цинка. Наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозной (2x30 см) уравновешенной 0,02 М раствором уксуснокислого аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка и элюируют градиентом от 0,02 М до 0,5 М раствора аммония уксуснокислого, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Фраксодержащие Нуклеазу S. объединяРезультаты очистки приведены в табл.1. В результате получают 110 мл ферментного раствора, активность .23,300 ед/мг белка, выход 23 по активности, степень очистки 160 раз (табл. 1).

т

- а.S

Е; ю та

« ч о.

п «о о.

о

СП

vO

о

с

tM .-э

ч

о

г см

rf см.

rri

1/Л го см

о

о

го

о vO

-ч1Л см -а-.

СП

сэ

о.

сэ

Ln чО