Способ получения антибиотика реумицина Советский патент 1977 года по МПК C12D9/14 

1

Изобретение относится к химика-фармацевтической про1 ишленности.

Способ получения антибиотика реумицина в патентной литературе не описан .

Целью изобретения является получение антибиотика реумицина, обладающего противоопухолевой активностью.

Для этого культуру Actinomyces rectus bruncus штамм 5000-23 выращивают на среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последуюи№1м выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционными

методами.

Морфолого-культуральные признаки реумицина.

Морфология: спороносцы прямые, споры овсшьные, собранные в цепочки.

Культуральные признаки: на агаризованных синтетических средах (среда Гаузе 1, СР-1 с глюкозой и другие) зрелая культура (8-12 дней роста) имеет хорошо развитый воздушный мицелий розового цвета; субстратный мицелий о кремоватого до темно-каштанового цвета. Среда приобретает окраску аналогичную цвету субстратного мицелия. Па агаризованной органической среде

(кукурузная № 6) : воздушный мицелий скудный, цвет кремовый или бледно-розовый; субстратный мицелий - бесцветный, пнгмент в среде отсутствует.

Физиологические свойства: желатина разжижается, молоко пептонизируется, сахароза инвертируется, крахмал не гидролизуется, на клетчатке роста нет Культура Act. neciua bruneus шт. 5000-23 хорошо использует различные источники углеводов: арабинозу, ксилозу, рамнозу, глюкозу, маннозу, галактозу, мальтозу, раффиназу, слабо лактозу; не потребляет маннит, сорбит и другие многоатомные спирты.

Антимикробные свойства: культуральная жидкость Act. rectos ,b nj«as шт. 5000-23 практически не обладает антагонистическим действием в отношении ряда грам1 етоложительных (StophuC. CKJf eus , Bocie . stibtitisи пр.,граммотрицательных (fscher. coCi и др. кислотоустойчивых (Mucobact.ef4tifnph6 i) бактерий и дрожжеподобных организмов (Comdido oEbicans и др.).

Освоен процесс глубинного биосинтеза реумицина в условиях опытных ферментеров .

Для получения антибиотика реумици на культуруАсЬ. r ectu« feruneosшт. О 5000-23 выращивают на жидких питательных средах с различными источниками азотистого питания как органического (кукурузный экстракт, рыбная, соевая мука, пептон и др.), так и ми-нерального происхождения (аммонийный и нитратный i азот), и различными ис очниками углеводистого питания (глю,коза, крахмал, глицерин) в различных сочетаниях; рН среды 6,8-7,0. Температура культивирования 26-28 Основные ингредиенты питательной среды потребляются к 40-64 ч ферментации этот период сопровождается максимальным накоплением мицелиальной массы. Противоопухолевая активность в культу ральной жидкости появляется на 16 20 ч роста и достигает максимума к 64-90 ч. Контроль за накоплением антибиотика в процессе ферментации производит ся с помощью метода Миамура основанного на подавлении дегидразной активности опухолевых клеток или метода культуры ткани. Культуральная жидкость, обладающая способностью подавлять дегидразную активность опухолевых клеток в разведении 1:80, 1:160 удовлетворяет требо ваниям для выделения и очистки препарата. Противоопухолевое вещество содержится в культуральной жидкости, главным образом, в растворенном состоянии Контроль процесса выделения противоопухолевого вещества из культуральной жидкости, а также оценка получения препаратов осуществляются биологическим способом в опытах на животных с привитыми опухолями. Для выделения антибиотика из культуральной жидкости могут быть использованы : а) адсорбция на активированном угле с последую щей десорбцией ацетоном или другими органическими растворителями; б) экстракция не смешиваю1цимися с водой органическими растворителями : спирtOM, эфирами, хлорированными углеводородами, бутиловым спиртом, этилаце татом и др. в) адсорбция ионообменными смолами и десорбция растворами кислот. Йа коицентрат.ов, полученных первыми двумя (а, б)Споеобами, противоопухолевое вещество осаждают избытком петролейного и диэтилового эфира. Получвнный таким образом препарат представля.ет собой аморфный порошок кремо вого цвета, растворимый в воде, низших спиртах, диметилформамиде и нерас творимый в пвтролвйном эфире. Противоопухолевое действие реумици на изучаютiна моделях следующих перевиваемых опухолей ЖИВОТНЫХ опухоль Эрлиха в плотной и асцитной формах, саркома 180 (с-180) в асцитной и плот ной Фоомах, саркома 37 (С-З) в асцит ной и плотной формах, лимфаденоз НК/ли лимфосаркома-1 (ЛИО-) ышeй, карциносаркома Уокера и саркома 45 (С-45) крыс. Пример 1. Зрелой (8-12-дневной) культурой Act. rectos bruneue шт. 5000-23 с агаризованной среды СР-1 с глюкозой засевают маточные колбы (Эрленмейера на 750 мл) с ферментационной средой (125 мл) следующего состава (%): кукурузный экстракт 0,5 (по сухому весу), сернокислый аммоний 0,35 глюкоза 1,0, крахмал 1,5, натрий хлористый 0,5, кальций углекислый 0,5. Засеянную культуру выращивают на круговой качалке (скорость вращения 230240 об/мин) при температуре 26-28 С в течение 48 ч. Из маточных колб стерильной пипеткой отбирают мицелиальную массу и засевают партию посевных колб с той же средой, выращивают на качалке в течение 48 ч. В ферментеры (емкость 45 л) помещают ферментационную среду (25 л) вышеуказанного состава, стерилизацию которой проводят при 122-124 С в течение 35 мин. Затем эту среду засевают посевным мицелием (2% к o6TjeMy среды) . Процесс ферментации протекает 8590 ч при слабокислом (6,6) или нейтральном (6,8-7,0) значении рН и полном потреблении углеводов к 60-64 ч.Противоопухолевая (антидегидраэная) активность появляется к 16-20 ч глубинного роста культуры и достигает максимума к 64-88ч. За активную культуральную жидкость принимается такая, которая в разведении 1:80 способна подавлять дегидразную активность раковых клеток. По достижении максисума активности процесс ферментации заканчивается. Затем из культуральной жидкости выделяют и химически очищают биологически активное вещество. Для этого 18 л нативного раствора с рИ 6,8-7,0 помещают в аппарат, снабженный мешалкой, и при непрерывном перемешивании проводят подкисление 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 3-2,5 (определяют по индикатору бромфенолу синему). Затем приливают в аппарат 6 л н-бутилового спирта, что составляет 30% от объема нативного раствора, и в течение 30 40 мин при непрерывном перемешивании проводят экстракцию активного вещества в бутанол. По истечении указанного времени , выключают и оставляют жидкость расслаиваться. Через 3-4 ч сливают нижний слой (маточный раствор) а затем верхний (Г экстракт) - в буты.ли.Маточник засасывают в аппарат, приливают 3,6 л бутанола (20% от нативного раствора) и в течение 15-20 мин при кепрерывно и перемешивании проводят вто рую экстракцию. По окончании ее отключают Мешалку, и после отстаивания в аппарате в течение 30-40 мин нижний слой сливают в трап, а верхний (g бутанольный экстракт) объединяют с I бутаиольным экстрактом и в течение ночи выдерживают в холодильнике; при этом происходит частичное расслаивание эмульсии. Часть прозрачного верхнего слоя отделяют, а стойкую эмульсию раэрушаиот Фильтрованием под вакуумом через слой ваты и фильтровальной бумаги. Получают 8-9 л экстракта темно-коричневого цвета, который упаривают по вакуумом до объема 15-20 мл, и добавлением 150-200 мл петролейного эфира (10-кратный объем) осаждают препарат. Осадок отфильтровывают, прог-ывают вна чале петролейным, а затем диэтиловым эфиром и высушивеиот при комнатной тем пературе в вакуум-эксикаторе до посто янного веса. Получают 2-3 г антибиотика, которы представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета, частично растворикый в воде. Его распределяют между водой и бутанолом. Из водного раствора получают 0,8-1,5 г кремового порошка, хорошо растворимого в воде, низших спиртах, а также диметилформамиде; ограниченно растворимого в ацетоне, хлороформе, бензоле (как на холоде, так и при повышенной температуре) ; практически не растворимого в петролейном и диэтиловом эфирах. Препарат считывается активным, если он обладает антидегидразной активностью в концентрации 1 мг/мл. Пример2. 19л культуральной жидкости, полученной по способу, описанному в примере 1, после отделения мице)тиальной массы (рН 6-7) перемешивают в течение 40-50 мни с 95 г активированного угля. Уголь отфильтровывают, промывают 2-3 раза дистиллированной водой(300 МП) и высушивают на воздухе. Элюацию активного вещества пр&водят дважды десятикратным количеством ацетона (950 мл) Ацетоновые экстракты объединяют, упаривают в вакууме (10-20 мм рт.ст.) при температуре водяной бани 35-40С и остаток в виде маслянистой массы темио-желтого цвета растворяют в 20 мл метилового спирта. Двухкратной экстракцией петролейным эфиром (2 раэа по 20 мл) удаляют масла, а метанольный слой упариBeuoT в вакууме. Остаток растворяют в 10 МП смеси метилового и бутилового спиртов (1:1), и активиое вещество осаждают ТО мл эфира. Маточный раствор (темно-желтого цвета) сливают декантацией, осадок хсфсшо отжимают на фильтре Шотта, пpo «dвaют эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Получают 0,7 л препарата в виде аморфного порошка кремового цвета, соответствующего по свойствам препарату, полученнс иу по примеру 1. Формула изобретения Способ получения антибиотика реумицина, отличающийся тем, что культуруАЛ потусеа rectue Ъгчлпеиз штамм I 5000-23 выращивают иа среде, содержащей источник азота, углерода и минеральные соли, с последующим выделеиием целевого продукта из Фильтрата культуральной жидкости адсорбционными или экстракционными методами.