Способ получения 5 -нуклеотидов Советский патент 1975 года по МПК C07D51/50 

1

Изобретение относится к улучшенному способу получения соединений, которые находят применение как промежуточные вещества в синтезе различных лекарственных препаратов и витаминов.

Известен способ получения 5-нуклеотидов путем ферментативного расщепления нуклеиновых кислот ферментом - экзонуклеазой А-5 актиномицетов.

Такой способ характеризуется неустойчивостью фермента к нагреванию и невозможность его повторного использования при проведении процесса в растворе. Это ограничивает выход 5-нуклеотидов на единицу активности фермента. Кроме того, целевой продукт получается загрязненным и требуется дополнительная очистка.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта на единицу активности фермента за счет перевода фермента в водонерастворимое состояние. При этом фермент становится термостабильным, его можно использовать многократно.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что раствор нуклеиновых кислот в буфере с рН 9 подвергают ферментативному гидролизу врдонерастворимым ферментом - экзонуклеазой А-5 актиномицетов, ковалентно связанным с органическим или неорганическим носителем, например модифицированными хромосорбом Р, полиакриламидом или диазотированной л«-аминобензилоксиметилцеллюлозой. При этом сохраняется 30-90% исходной активности фермента (в зависимости от типа носителя и молекулярного веса субстрата). Так как фермент переведен в водонерастворимое состояние, то при осуществлении предлагаемого способа получают 5-нуклеотиды путем многократного использования связанного фермента в виде суспензии, во взвешенном слое, в проточной колонне в качестве насадки и т. п. В течение месяца нуклеазная

активность такого фермента снижается лишь на 5-25%.

Пример 1. Твердый носитель для газожидкостной хроматографии - хромосорб Р кипятят в 0,1-0,2%-ном растворе у-аминопропилтриэтоксисилана в органическом растворителе в течение 24 час. Полученное при этом промежуточное производное обрабатывают 1-2%-ным водным раствором глутарового альдегида при О-5°С в течение 0,5-

2 час и затем перемешивают с 0,1-2%-ным раствором фермента - экзонуклеазой актиномицетов от 4 до 24 час при 4°С. Полученный водонерастворимый ковалентно связанный с хромосорбом Р фермент обладает нуклеазной

активностью.

Ферментолиз нуклеиновых кислот. Проточную колонну, термостатированную при температуре 37°С, заполняют водонерастворимым ферментом иа носителе - хромосорбе Р. На колонку нодают 1-10%-ный раствор нуклеиновых кислот в буфере с рН 9 со скоростью 10--300 мл/час. Нуклеиновые кислоты разлагаются до 5-нуклеотидов неизменно .в течение месяца непрерывной работы. Водонерастворимый фермент теряет при этом 10-15% первоначальной активности. 5-Нуклеотиды разделяют на ионообменной колонне, идентифицируют с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии, а также 5-нуклеотидазы и по УФ-спектрам.

Предмет изобретения Способ получения 5-нуклеотидов путем ферментативного гидролиза раствора нуклеиновых кислот в буфере с рН 9 ферментом -- экзонуклеазой А-5 актиномицетов с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта на единицу активности фермента, процесс проводят с водонерастворимым ферментом, ковалентно связанным с органическим или неорганическим носителем, например модифицированным хромосорбом Р, полиакриламидом или диазотированной ж-аминобензилоксиметилцеллюлозой.