СПОСОБ ОЧИСТКИ 5 -ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ ACTINOMYCES COELICOLOR ОТ ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗЫ Советский патент 1981 года по МПК C07G7/28 C12D13/10 C07H19/00 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической проквлшленности и может быть использовано при получении 5-экзонуклеазы, не содержащей примесей фосфомоноэсхеразы. 5-экзонуклеазу используют для получения з-нуклеотидоз путем гидролиза нуклеиновых кислот. Примесь фосфомоноэстеразы вызывает практичес ки исчезновение 5-нуклеотидов из реакционной смеси за счет дальнейшего превращения их в нуклеози;п1Ы. Известен способ очистки 5-экзонуклеазы из Actinomyces coelicolor шт.А-5 от фосфомоноэстеразы.Очистка целевого фермента включает хроматографию на сефадексе G-75,диэтиламино этилсефадексе А-50, диализ, после че го полученный ферментный раствор про гревают в присутствии 2-меркаптоэтанола при 37С и рН 5,5 в течение 4090 мин. Далее проводят фракционирова ние, т.е. разделение ферментов хрома тографией на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-50. 2-Меркаптоэтанол, добавляемый при прогреве ферментного раствора, играет роль стабилизирующей добавки для 5 зкзонуклеазы, вызывая в то же время резкое уменьшение стабильности фосфомоноэстеразы; Соотношение 5-экзонуклеаза /фосфомоноэстераза после фракционирования составляет 10000 l. Недостатком известного способа является многостадийность, а также наличие примесей фосфомоноэстеразы в целевом продукте. Кроме того, данный способ может быть реализован только в лабораторных условиях вследствие большого числа трудноосуществимых хроматографических операций. Цель изобретения - упрощение технологической схемы процесса и улучшение качества получаемого продукта, т.е. более полная очистка от фосфомоноэстеразы. Указанная цель достигается способом очистки 5-экзонуклеазы Acttnomyces. coel i со 1 о г от фосфомоноэстеразы, который заключается в прогревании ферментного раствора в присутствии стабилизирующих добавок - сульфата аммония и РНК при 45 - 50 С в течение 40-90 -мин и двухстадийном фракционировании ацетоном соответственно 0,5 и 2,0 объемами по отношению к объему, исходного раствора с отдоле.11ием после первой стадии осадка фосфомоноэстеразы, В способе предпочтительно используют Б-экзонуклеазу Actinomyces сое licofor шт. А-18, причем обычно в виде 4-6%-ного раствора в 0,005 М трио-НС t буфере, содержащем 10 MgC Сульфат аммония обычно используют а количестве 8-11% от насыщения, а рибонуклеиновую кислоту - 0,9-1%. Способ осуществляют следующим образом. Штамм-продуцент Act. сое 11 со lor выращивают на подходящей питательной среде при 30°С в течение 48 ч, фильтруют и из охлажденного раствора осаждают неочищенный фермент 5 --экзонуклеазу при добавлении 2,5 объемов ацетона ., Соотношение единиц 5 -экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активнос тей находится в пределах 10 - 100. Для очистки от фосфомоноэстеразы препарат растворяют в буфере рН 6,6, к раствору добавляют РНК (на одну весовую часть фермента 0,2 вес.ч. РНК) и сульфат аммония в количестве 57 г/л, т.е. 10% от насыщения. Смесь имеет рН 4,7, ее нагревают до 50 С и выдер живают 40-90 мин, затем охлаждают и определяют соотношение 5-экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активнос тей. Установлено, что оно находится в пределах 2000-10000. К раствору .добавляют 0,5 объема ацетона и центрифугируют, из супернатанта осаждают 5-экзонуклеазу добавлением еще 2,0 объемов ацетона. Осадок фермента высушивают. Выход 5-экзонуклеазы составляет 45-50% от неочищенного препа рата. Фосфомоноэстеразная активность не проявляется при инкубации фермента с субстратом в течение 3-х ч и десятикратной концентрации фермента в инкубационной смеси. В опытах- по гидролизу РНК с анали зом продуктов гидролиза методом тонкослойной хроматографии обнаруживают ся только нуклеотиды, а нуклеозиды полностью отсутствуют. Следовательно, очищенный ферментный препарат пригоден для получения нуклеотидов из нуклеиновых кислот. Предлагаемый способ основыв.ается на том, что при тепловом воздействии происходит денатурация, главным обра зом фосфомоноэстеразы, за счет чего и происходит очистка 5-экзонуклеазы от этой примеси. Обнаружено, что добавление рибонуклеиновой кислоты и сульфата аммония приводит к избирательной стабилизации 5 -экзонуклеазы благодаря чему фермент выдерживает более высокую температуру (до 50 С) в сравнении с известным способом (37 С). Кроме того, согласно известному способу, 5-экзонуклеаза неустойчива при рН ниже 5,0. В предлагае мом способе предпочтительно применяется рН ниже 5,0, так как 5-экзонуклеаза в присутствии добавок (РНК и () стабильна в этих условиях, а фосфомоноэстераза, наоборот, инактивируется тем сильнее, чем ниже рН (см. ваблицу) . Из данных таблицы видно, что проСревание ферментного раствора при рН 4,7 приводит к инактивации фосфомоноэстеразы на 91%, а 5-экзонуклеазы всего на 37%.. Дальнейшая очистка 5 -экзонуклеазы от остаточной фосфомоноэстеразы достигается осаждением органическим растворителем. Фракция, осаждаемая 0,5 объе-мом ацетона, содержит всю фосфомоноэстеразную активность и лишь 5-10 % 5-экзонуклеазы. Вторая фракция,осаждаемая после дополнительного введения двух объемов ацетона, содержит 5-экзонуклеазу, свободную оТ примесей фосфомЬноэстеразы. Пример . Выращивают Act. сое 1 со lor штамм А-18 в ферментере емкостью 1 м при 30°С в течение 48 ч на питательной среде, содержащей пшеничную муку, обработанную о(.-амилазой, осахаренный крахмал, и соли. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием на фильтрпарлите, фермент содержится в фильтрате. К фильтру добавляют MgCI ДО конечной концентрации м и 2 М НС 1 до рН 5,5. Раствор охлаждают до 4с и к нему добавляют 2,5 объема охлажденного до ацетона. Выпавший осадок через 15 мин отделяют сепарированием (4 000 об/мин) и высушивают в вакууме. Соотношение 5 -экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активности составляет 90. Выход препарата 8,7 г/л культуральной жидкости. 10 г этого препарата растворяют в 200 мл 0,005 И трис -НС1 буфера рН 6,65, содержащего 1-10 М MgClj. He-растворившийся осадок отделяют центрифугированием 3000 об/мин и отбрасывают. К 180 мл раствора добавляют 1,8 г РНК, перемешивают до полного растворения, добавляют еще 10,25 г (ННд) , рН раствора смещается до значения 4,7 за счет РНК. Полученную смесь (180 мл) нагревают до в течение 1 ч, охлаждают до А°С и добавляют 90 мл ацетона (0,5 объема), охлажденного до 4С. Через 30 мин

отделяют выпавший осадок центрифугированием, а к раствору повторно добавляют ацетон ) в количестве 380 мл (2 объема) . В павший второй осадок, содержащий 5 -экзонуклеазу, собирают в вакуумах центрифугированием (3000 об/мин) и высушивают в вакууме. Выход составляет 4 г и 47% по ферментативной активности от неочищенного препарата. Фосфомоноэстеразная активность не обнаруживается при увеличении концентрации фермента в 10 раз и времени инкубации с субстратом в 4 раза. Из продуктов гидролиза РНК методом тонкослойной хроматографии обнаружены только нуклеотиДЫ.

Таким образом предлагаемый способ очистки 5 -экзонуклеазы позволяет получать 5-экзонуклеазу, синтезируемую Act. сое 11 col or, не содержащую примесей фосфомоноэстеразы. 5-экзонуклеаза может найти применение в пищевой промьшшенности и медицине для получения куклеотидов из нуклеиновых кислот.

В отличие от известного способа предлагаемый способ легко может быть реализован в условиях завода. :

Формула изобретения

1. Способ очистки 5 -экзонуклеазы Actinomyces соеПcol or от фосфомоноэстеразы, включающий прогрев ферментного раствора ч присутствии стабилизирующих добавок в течение 40-90мии и фракционирование, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества получаемого продукта, прогрев осуществляют при рН 4,7-5,0, при 45-50 0, в качестве стабилизирующих добавок используют сульфат аммония и рибонуклеиновую кислоту, а фракционирование осуществляют ацетоном в две стадии, соответственно 0,5 и 2,0 объемами по

0 отношению к объему исходного раствора с отделением после первой стадии осадка фосфомонозстеразы.

2. Способ оо п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что используют 5-эк5 зонуклеазу Actinomyces сое И col or шт. А-18.

.3. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что в качестве исходного используют 4-6%-ный раствор фермента в 0,005 М трис-НСЬ буфере, со0держащем 10 М MgCl.

4. Способ по п. 1,стлича ющ и и с я тем, что сульфат аммония используют в количестве 8-11% от насыщения, а рибонуклеиновую кислоту

5 в количестве 0,9-1,0%.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Львова Т.Н., Артамонова О.И.,

30 Татарская Р.И. .Метод получения препарата экзонуклеазы А-5, свободного от примесей фосфомонозстераз. Вып. 4. Биохимия, 1975, т. 40, с. 703-710 (прототип).