Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы Советский патент 1976 года по МПК C07G7/00 C07H1/00 

1

Изобретение относится к области биохимии ферментов и касается способа получения модифицированного (иммобили-зовавного) фермента панкреатической рибонуклеазы.

Для модификации панкреатической рибонуклеазы известны многочисленные приемы ковалентного связывания ее с различными полимерньвш матрицами 1. Для методов ковалентного связывания используют целый ряд активированных носителей. Среди них известна активация полимерной матрицы обработкой раствором хлористого М-(.и-нитробензилоксиметил)-пиридиния с прогреванием прн 125°С (2.

Однако в настоящее время отсутствуют данные о соотношении синтетазной и гидролазной активности для модифицированных форм фермента и влияния характера связывания фермента с полимерной матрицей на его синтетазную активность в реакциях синтеза олигонуклеотидов. Для нативных форм рибонуклеазы отношение «синтез/гидролиз в реакциях полимеризации составляет, как правило, около единицы.

С целью получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы с повышенной синтетазной активностью (т. е. увеличенным отношением «синтез/гидролиз) по предлагаемому способу для модификации рибонуклеазы используют новый метод ковалентного связывания ее с активированными матрицами через .и-амипобензилоксиметильный радикал.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что панкреатпческую рибопуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонерастворимой матрицей - ХНа-целлюлозой или с актпвированиой водорастворимой матрицей -ЫЬЬ-полиглюкином при температуре от 0°С до 20С. Матрицу активируют обработкой раствором хлористого Х-(лг-и1ггробеизплокспметил)-п11рпд11ИИ но известному способу.

У иммобилизованных препаратов рибонуклеазы определяют синтетазную активность.

Модификация рибонуклеазы состоит из двух стадий: активации матрицы и связывания фермента. Пример 1. А. Активация водоиерастворнмой матрицы.

1 г целлюлозы смешивают с 200 мг хлористого N- (л-нитробензилоксиметил)-пиридиния, растворенного в 2 мл 0,7%-ного раствора СПзСООХа, высушивают в эксикаторе и прогревают 40 мин при 125°С. Промывают водой,

бензолом и восстанавливают гидросульфитом натрия (30 мин при 50-60°С). Вновь промывают водой, 30%-ной уксусной кислотой и снова водой. 300 мг аминоцеллюлозы охлаждают в 3 мл

5%-ной ПС1, ири перемешпванип добавляют

3 мл 4%-ного NaNOa в 5%-ной НС1, быстро промывают холодной водой.

Б. Связывание фермента с водонерастворимой матрицей.

1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы :в трис-НС1-буфере (0,02 М, рН 7,3; 20 мг/мл) добавляют ь диазотированной целлюлозе, перемешивают и добавляют 2 мл 0,2 М трис-НС1-буфера (рН 8,5). Смесь перемешивают 3 час и оставляют на ночь. Связывание проводят при . Аналогичным образом проводят связывание при . Связанные препараты отмывают от несвязанных холодной водой.

Количество связанной рибонуклеазы по отношению к рибонуклеазе, взятой в реакцию, составляет для целлюлозы 40-i50%.

Пример 2.

А. Активация водорастворимой матрицы.

1 г полиглюкина смешивают с 200 мг хлористого N- (;И-нитробензилоксиметил) -пиридиния, растворенного в 2 мл 0,7%-ного раствора CHsCOOlNa, высушивают в эксикаторе и прогревают 30 мин при 100-110°С. Растворяют в воде и осаждают спиртом. Затем восстанавливают гидросульфитом натрия (30 мин при 50-60°С). Диализуют против воды, осаждают спиртом и высушивают эфиром.

300 мг аминополиглюкина растворяют в 3 мл 5%-пой НС1, охлаждают и добавляют при перемешивании 3 мл 4%-ного NaN02 в 5%-мой НС1. Через 1 мин осаждают двойным объемом холодного спирта. Осадок снова обрабатывают спиртом, дважды эфиром, быстро высушивают и растворяют в 2 мл холодной воды.

Б. Связывание фермента с -водорастворимой матрицей.

1 мл раствора панкреатической рибонуклеазы в трис-НС1-буфере (0,02 М рН 7,3,

20 мг/мл) добавляют к 2 мл диазотированного полиглюкина, перемешивают и добавляют 2 мл 0,2 М трис-НС1-буфера (рН 8,5). Смесь оставляют на ночь. Связывание проводят при 20°С.

2,5 мл рибонуклеазы, связанной с аминополиглюкином, помеш,ают на колонку с сефадексом 1 100 и элюируют 0,02 М трис-НС1-буфером (рН 7,8) с 0,14 М NaCl.

Аналогичным образом проводят связывание при 0°С.

Количество связанной рибонуклеазы составляет 20-25% по отношению к рибонуклеазе, взятой в реакцию.

У полученных связанных препаратов определяют содержание белка биуретовым методом.

Очишенные препараты анализируют на синтетазную активность.

Ниже приводится пример, нллюстрируюш,ий повышение синтетазной активности.

Синтез днцптидинмонофосфата (СрС). Готовят реакционную смесь следуюшего состава: Панкреатическая рибонуклеаза (РПК-аза) 0,8 мг/мл 0,02 мл

Цитидинциклофосфат (Ор)

(Na-соль)12,5 мкмоль 4,5 мг

Цитидин (С)37,5 мкмоль 9,2 мг

Трис-ПС1-буфер 0,06 М, рН 7,6 0,03мл

Смесь инюубируют при 0°С. Через определенные промежутки времени (1 час, 3 час, 23 час) из реакционной смеси отбирают пробы ПО 0,003 мл, которые анализируют при помощи электрофореза на бумаге в триэтиламмонийбикарбопатном буфере (0,05 М, рП 7,5, / 0,5 та/см, У 1000 в). Иидикацню пятен осушествляют по гашению флуоресценции в УФ-свете. Беш,ество с бумаги элюпруют 0,1 н. НС1. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при К 280 им.

Таблица 2 Таблица 3 OiHoojeHHe СрС/Ср, °/а через промежутки вреРНК-азамени, час Выход продуктов реакции синтеза (%) н связанной рибонуклеазы и связанной с NH полиглюкином представленыВ табл. 1. Выход продуктов реакции синтеза несвязанной рибонуклеазы и связанной с NH2-цeллюлозой представлен в табл. 2. Ф о р .м у л а изобретения Способ получения модифицированной панкреатической рибонуклеазы, включающий активацию матрицы хлористым К-(ж-нитробензилоксиметил)-т1иридинием при нагревании, отличающийся тем, что, с целью повыщения синтетазной активности, панкреатическую рибонуклеазу подвергают взаимодействию с активированной водонерастворимой матрицей МНг-целлюлозой или с активированной водорастворимой матрицей -ЫНз-полиглюкином при температуре О-20°С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1.Кестнер А. И.. Успехи химии, 63, 1480 (1974), вып. 8. 2.Курсанов Д. П. и Солоднов П. А. ж. прикл. химии, 16, 351, 1943.