Способ получения антибиотика Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к области медицины, в частности к производству антибиотиков.

Предлатаерся способ получения «ового антибиотика 8.036 R.P., где в качестве грибапродуцента используют штамм Steptomyces canadiensisNRRL 3155.

Штамм зарегистрирован в Северной областной исследовательской лабО|ратории в Преорип, Иллипойс, США под номером NRRL 3155.

Этот организм выделен из образца грунта, взятого в Канаде в провинции Квебек графства Бодрей, IB Сент Марте.

ОсЕОвные характерные признаки штамма Streptomyces canadiensis NRRL 3155.

Спороносные волокна прямые, ровные, описывающие легкие колебательные движения лишь случайно и только на ивкоторой части длины волокна или у его К01нца. Очень длинные, обычно превышают 100 м.

Str. canadiensis представляет собой аппарат опорообразующих воздушных органов розовато-серого цвета. Его характерная окраска лоно видна в некоторых крахмальных средах, где опорообразавание протекает хорошо и может -быть еше улучшено 1Присутст1вием земли.

Образует цилвндрические споры раз1мером (0,4-0,6) X (0,8-1,2) мш.

Агар-:а гар Беннетта. Развивается хорошо.

Субстратный мицелий Коричнево-желтый до светлого. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент корич-нево-желтый, светлый.

Агар-агар Эмерсона. Развивается хорошо. Субстратный мицелий коричнево-желтый до светлого. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент от .коричневого до желтого светлого.

Агар-агар триптоновый. Субстратный мицелий коричнево-желтый, хорошо развит; воздушный мицелий Оветло-сероватый; растворимый пигмент коричнево-желтый, темный. Агар-агар глюкозо-пентоновый. Субстратный мицелий хо-роШО развит, коричнево-желтый, местами черно1ватый; воздушный мицелий отсутствует; растворимый пигмент коричнево-желтый, сероватый.

Питательный агар-агар. Степень развития

слабая. Обратная сторона колоний сероватожелтая, развитие слабое; воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Глюкозо-аспарагиновый агар-агар. Обратная сторона колоний коричнево-желтая, воздушный мицелий оветло-розовато-серый, растворимый пигмент светлый корИЧнево желтый.

Глицерино-аспарагиновый агар-агар. Субстратный мицелий от светло-желто-коричнево

го до светло-коричнево-желтого; воздушный

мицелий светло-серый, слегка розоватый, умеренно раз витый.

Агар-агар с малеатом кальция (Краинского). Развитие очень умеренное, обратная сторона .колоний от серовато-белого до желто1вато-белого, воздуш«ый .мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Агар-а гар с тирозином. Степень развития слабая. Субстратный мицелий от бесцветного до светло-серо-коричрневого. Растворимый питмент .коричневатый, светлый, малоинтенсввный.

Агар-агар с крахмалом. Развитие .культуры очнь умеренное. Субстратный ;миделий от серОвато-|белого до желтовато-белото. Воздушный мицелий светлый, сероватый, умеренно развитый. Растворимый пигмент сероватокорнчнево-желтый.

Атар-агар с крахмалом Граяди. Обратная сторона КОЛОНИЙ :коричнаво-желт;ая, светлая; воздушный мицелий светлый, разовато-серый; растворимый пигмент коричневато-желтый-серый.

Агар-агар с крахмалам Придхэма. Развитие Культуры хорошее. Субстратный мицелий коричнево-желтый. Воздушный мицелий светлый розовато-серый, развитие умеренное. Растворимый пигмент серо-желтый, слепка корИЧнешатый.

Синтетический агар-агар Чапека с глицерином. Развитие хорошее. Субстратный мицелий желто-коричнешаго цвета, хорошо развитый. Растворимый пигмент довольно интенсивный, желтый, слегка коричневый.

Синтетический агар-агар Чапбка с сахарозой. Субстратный мицелий хорошо развит, желто-1корИЧ1Нввый.

Картофельная среда. Развитие хорошее. Субстратный мицелий развит хорошо, от серовато-желтого до черновато-коричневого. Воздушный мицелий от беловатого до розовато-сарото, развитие умеренное. Растворимый пигмент в жуоке картофеля от желтовато-серого до черноватого, жидкость - оветло-желтая.

Морковная среда. Степень раз1вития умеренная. Субстратный мицелий серовато-.коричневато-желтый. Воздушный мицелий с беловатыми полосами. Растворимый .пигмент коричневый в моркови и желтый - в жидкости.

Чистый желатин 12%-ный. Культура хорошо развита .на поверхности в тОЧке коагуляции. Обратна.я сторона колои-ий черноватокоричневая. Воздушный мицелий серый, хорошо развит. Растворимый пигмент коричневожелтый, начиная с поверхности и распространяясь в зоне разжижения.

Бульон глюкозно-НИтратный ДимМика. Развитие .рреднее. Образует кольцо и пленку от беловато-желтого .до светло-желтого. Растворимый пигмент довольно обильный, светложелтый. Воздушный мицелий отсутствует.-, Снятое молоко. А. При тем1пер атуре.26°С- хорошо развитое кольцо желтого цвета; 1воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют;

Б. При температуре 37°С - слабо развитое кольцо коричнево-желтого цвета. Воздуш5 ный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Желатин - медленное неполное разжижение.

Малеат кальция растворяет хорошо. 10 Тирозин - видимое растворение отсутствует.

Крахм ал гидролизуется. Положительная реакция нитрита в течение первых 24 час .развития культуры, затем 15 быстро ;перехо.дя|Щая в отрицательную.

Молоко медленно пептонизируется без коагуляции при 26°С.

СероводО|род не образует. О.птимальная тем1пература роста штамма 20 25-35°С.

Способ получения антибиотика осуществляют следующим образом.

Культуру Streptomyces canadiensis NRRZ 3155 выращивают в глубинных условиях в 25 ферМентационном аэробном процессе на питательной среде, содержащий источники углерода и азота, минеральные сол.и и стимуляторы роста.

В качестве источника углерода можно ис30 пользовать гидраты углерода, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, .декстрины, крахмал, меласса, различные виды алкогольного сахара, органические кислоты - молочная, лимонная, винная, некоторые животные или ра5 стительные масла.

В качестве источника азота могут быть использованы нитраты, минеральные и органические соли амгмония, мочевины, аминовые кислоты, а также казеин, лактальбумин, глю0 тен и их гидролизаты, мука соевая, рыбная и арахисовая, мясные экстракты, дрожжи.

Из минеральных солей питательная средз может со.держать сульфаты, хлориды или фосфаты щелочных или щелочноземельных 5 металлов, карбонаты кальция или магния, а также активаторы роста - соли цинка, кобальта, железа, меди и марганца.

Ферментацию проводят при температуре

25-35°С, рН среды 6,5-7,5 и скорости аэра0 ции 0,3-2 л/л мин. Максимальный выход

антибиотика через 4-9 дней культивирования

в зависимости от используемой среды.

Антибиотик выделяют из культуральной жидкости известными приемами с етом его 5 физических, химических и биологических свойств.

Активность антибиотика о.пределяют методом диффузии, используя Staphylococeus aureus 209 Р в качестве тест-организма. 0 Антибиотик 8.036 R. Р. является сильной кислотой, нейтральный эквивалент которой 775 (рКа-4,45).

Элементарный состав, %: С 479- Н 71О 38,3; N 4,5; Р 2,2. Молекулярный вес вьше 500Q..

Физические свойства. Аморфный белый порошок. Точка плавления 235-236°С с разложением, выше 180°С приобретает коричневую окраску.

УФ-опбктр, определяемый, начиная с раствора 50 мг/л, в воде (толщина 1 см), не HLVieeT характерных ма1ксимумо1в, коэффипиент поглош,епия 2(..« увеличивается от О до 40 в интервале от 400 до 210 НМ.

IR-опектр в бромистоад калие представлен на чертеже, на котором по оси абсцисс с одной стороны нанесена длина воли в микр01нах (нижняя шкала), а с другой стороны частота волн в (верхняя шкала), по оси ординат - Оптические плотлости.

Химические свойства. Антибиотик 8.036 R. Р. легко растворим в воде, днметилформами,де, :пириди«е, уксусной кислоте; малорастворим или нерастворим в этаноле, ацетоне, хлороформе, н-гаксане.

В 1%-нОМ водном растворе устойчив при рН в пределах от 6 до 10.

Антибиотик дает отрицательные тесты при следующих реакциях: биуретовой, Миллана, Поли, Адамкевича, Эрлих-Сал1ков)ского, на хлориое железо, ксантО;Протеи1Н01Вой, на железистый малтол, Полленса, Мернера, Циммермана и Бито, диазотирования.

Дает положительные тесты -при следующих реакциях: на нигридин (слабо положительную до гидролиза, очень сильную после кислотного гидролиза), Молиша, Фолен-Денн, Сакагучи пОСле кислотного гидролиза, на пермангаиат -калия до гидролиза (отрицательный тест после гидролиза), на ди1Нитро-2,4, на фенилгид|разин после кислоънОГО гидролиза, ФеМинимальная бактериостатичесмая концентрация, мкг/см

Staphylococcus aureus, штамм

Р-АТСС 6538 Р

Staphylococcus aureus, штамм 133

Staphylococcus aureus, штамм Смит

Sarcina lutea - АТСС 9341

Streptococcus faecalis - АТСС 9790

Streptococcus viridans

Streptococcus pyogenes hemolyt

штамм Диг 7

Neisseria gonorrhaeae (A 50)

Neisseria miningitidis (581.3)

Diplococcus pneumoniae, штамм Тиль

Bacillus subtilis - ATCC 6633

Bacillus cereus - 6630

Mycobacterium species - ATCC 607

Mycobacterium para - smegmatis (A

Escherichia coll - ATCC 9637

Shigella dysenteriae-Shiga L

Salmonella paratyphi A

Salmonella schottmuelleri (паратиф

Фоженс

Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae - ATCC 1003 Pseudomonds aeruginosa, штамм Бас Brucella bronchiseptica (CN-387) Pasteurella multocida (A 125) Treponeme de Reiter

лннга после кислотного гидролиза, реакциях Биала, Таубера, Эльсояа-Моргана после кислотного гидролиза, Дише и Боренфрейнда, Селиванов-Роз, Пехмана, реакции на сернистый индол, на цистеин-карбазол, иа железоcиiнepoдиcтый калий и хлорное железо.

Бактериостатичеокую активность антибиотика 8.036 R. Р. определяют методом разведе- . Ния. Результаты различных определений представлены в таблице, где минимальные бактериостатичеокие концентрации выражены в микрограм мах вещества на 1 см опытной среды.

Обладает высокой активностью в отношеНИИ грамположительных микроорганизмов и некоторых грамотрицательных.

По своему действию он не перекрещивается такими антибиотиками, как .пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол, спирамицин, «арбомицин, эритр01МИцин, пристинамицин и новобиоцин.

Антибиотик обладает большой продолжительностью действия и слабой то.ксичнастью. Пример 1. В ферментер 1 емкостью 170 л загружают (г):

NZ-амин типа Е1200

Мясной экстракт720

Гидратированная глюкоза1200

Соевое масло60 (мл)

Агар-агар120

ВодаДо 150 (л)

После установления рН среды 7,05 добавлением 90 см 10 н. соды смесь стерилизуют 40 мип посредством барботирования паром при 122°С. После охлаждения объем бульона составляет 120 л, а рН - 6,9. Затем лроиэводят посев 200 см Streptomyces canadiensis, подготовленной в колбе Эрленмейера при перемешивании.

Культура развивается 32 ч при , постоянном перемешивании и аэрировании стерильным воздухом.

Производственную культуру получают в ферментере 2 емкостью 800 л, загруженном питательной средой следующего состава (кг); Отмоченная кукуруза8,0

Гидратированная глюкоза4,0

Соевое ма сло8,0 (л)

Углекислый кальций4,0

Сульфат аммония0,4

Хлористый гексагидрат кобальта0,006

ВодаДо 370 (л)

Среду с рП 6,2 стерилизуют 40 мин барботированным паром при 122°С. После охлаждения объем бульона составляет 400 л, рН 7,1. Бульон засевают 40 л инокулята из ферментера 1.

Культура созревает 156 час при 27°С и перемешивании турбиной, вращающейся со скоростью 260 об/мин, пои скорости аэрации 15 , ipH среды 7,25.

Активность культуральиой жидкости1625 ед/смз.

Пример 2. Ферментер 2 с культуральной средой, описанной в приме1ре 1, засевают инокулятом. Культивируют 156 ч при 33°С, иастояЕНОм перемеши1вании турбииой с 160 об/мин и скорости аэрадии 25 .

рН среды 7,45, объем сусла 340 л.

Активность культур ал ьной жидкости 3215 ещ/смз.

Пример 3. Культуральные жидкости, полученные по примерам 1 « 2, лервмешивают. 740 л сусла с титром 2420 ед/см при рН 7,3 доводят до рН 2 добавлением 10 и. серной кислоты в ванне, оснащенной смесителем. После этого вносят 18 ,кг фильтровальной добавки.

Омесь фильтруют через фильт1р-пресс, и осадок от фильтрО1вания промывают 250 л водопроводной воды. Фильтрат и неактивную воду отб)расывают. Остаток от фильт1рации помещают при деремешивании в виде суспензии в 388 л смеси метанола (268 л) и воды (120 л).

рН Суспензии доводится до 7 добавлением 10 «. соды.

Перемешивание продолжается 1 час, а затем pacTiBOp фильтруют на фильтр-прессе. Фильтрат отделяют, а осадок вромывают 150 л 70%-його метанола. Фильтрат и промьшка составляют вместе 530 л с активностью 3400 ед/ом. Осадок выбрасывают. Алкогольный фильтрат концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) при 35°С до объема 5,2 л.

Антибиотик выпадает при добавлении 40 л этанола. Выпавший антибиотик отжимают, прОМывают этанолом, а затем высущивают в сушильном шкафу под пониженным давлением (5 мм рт. ст.). Получают 885 г светлосерого продукта с титром 1790 едАмг.

Пример 4. 880 г неочищенного антибиотика, полученного в примере 3, раст(воряют в 20 л воды с рП 7. Водный раствор фильтруют, затем прО|Пускают через колонку Дошех (35 л) 1X2 в хлористом цикле. Вытекающую жидкость удаляют. Смолу промывают 80 л воды, затем 80 л смеси воды с муравьиной кислотой (90:10 по объему). После этого промывают смесью метанол : вода : (муравьиная кислота (80 : 10 : 10) и, наконец, смесью метанол : вода (80 : 20).

Антибиотик извлекают после всех этих операций 300 л смеси метанол : вода (80:20), содержащей 10 г/л хлористого калия. Среднюю фракцию, объем которой 120 л, концентрируют до объема 5 л под пониженным дав.лением (20 мм рт. ст.) при температуре 40°С.

Концентрат диализируют 24 час против диСтиллироваиной воды сквозь мембрану из регенерированной целлюлозы с целью удаления минеральных солей и различных органических загрязнений.

Диализированный раствор (6,8 л), содержащий (весь извлеченный антибиотик, концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) до 0,8 л. К полученному концентрату

добавляют 5 равных ему объемов ацетона - выпадает калиевая соль антибиотика. После фильтрации, промывки и просушки в течение одной ночи при 35°С под давлением

2 мм рт. ст. получают 195 г светло-коричневого порошка с активностью 5680 ед/мг.

Пример 5. 175 г продукта, полученного по примеру 4, растворяют в 3,5 л воды с рП 7. Водный раствор пропускают через (колонку Дowex (15л) 1X2 в хлористом цикле. Стекающую жидкость удаляют. Смолу последовательно промывают в 15 л дистиллированной воды, 20 л смеси воды с муравьиной кислотой (90: 10 по объему), 40 л смеси метаНОЛ : вода : муравьиная кислота (80 : 10 : 10). Антибиотик извле1кают 75 л смеси метанол : : вода (80 : 20), содержащей 10 г/л хлористого калия.

Среднюю фракцию элюата (40 л) концентрируют до 1,1 л под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) и температуре ниже 40°С, концентрат диализируют в течение 24 час против дистиллированной воды через мембрану из регенерированной целлюлозы.

Диализированный раствор, содержащий всю активность средней фракции (1,5 л), концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) до объема 200 ом. К полученному концентрату доба1вляют 5 объемов

ацетона для осаждения антибиотика в виде солей калия.

Выпавший осадок отжимают, промывают ацетоном, прооушнвают в течение ночи при 35°С и пониженном давлении (2 мм рт. ст.).

Получают 98 г калиевой соли антибиотика в виде белого порошка с активностью 8000 ед/мг.

Пример 6. 5 г калиевой соли антибиотика, полученной по примеру 5, с титром

8000 ед/1мг ра1Спворяют в 50 см смеси н-пропанол:вода (50:50). Раствор поступает в колонку, содержащую в суспензии окись алюминия с рН 4 в смеси п-пропанол: вода (75:25).

Антибиотик извлекают из смеси порциями по 200 ом н-пропанол : вода (50 : 50), затем по 200 см н-иропанол : вода : концентрированный аммиак (d - 0,925) (50:49,5:0,5 по объему).

Вытекающая жидкость поступает частями по 10 ом, и акти:аность каждой части определяют биологической дозировкой.

О|богащенные фра)Кции элюата н-пропанол: вода (50:50), фра1кции от 3-ей до 11-ой соеДИ1НЯЮТ вместе и концентрируют при пониженном давлении (20 мм рт. ст.) и температуре не выще 40°С до объема 10 см.

Концентрат разводят 10 ом ,н-пропапола и 10 ом ацетона для осаждения антибиотика.

После фильтрации, промывки ацетоном и просущки в течение ночи при 35°С и пониженном давлен)ии (2 мм рт. ст.) получают 2,4 г калиевой соли антибиотика с активностью 9150 ед/мг.

Обогащенные фракции элюата н-пропанол:

: вода ; концентри рован«ый аммиа-к (50 : 49,5 ; :0,5), фракции от 23-ей до 40-ой, соединяют вместе и обрабатывают вышеописанным способом.

Получают 1,5 г .слабо окрашенного порошка с активностью 8500 ед/мг.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика, о т л и ч а f, Q ШО 2500

ющийСя те-м, что культуру Streptomyces саnadiensis NRRL 3155 выращивают в аэробных усло;виях на питательной среде, содержащей и-сточ1НИКи углерода, азота, -минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделениОМ и очи€Т1кой целевого продукта известньши приемами. 2000