Способ получения антибиотика 2188 и штамм плесневого гриба РеNIсILLIUм RUGULоSUм FERM ВР-142,используемый для получения антибиотика 2188 Советский патент 1988 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/80 

см

Изобретение относи ся к микробиологической промьшшенности и может быть использовано в производстве антибиотиков.

Новый антибиотик 2188 представляет собой 3-(6-изоциано-З,7-диокса- трицикло 4.1.0. гепт-4-илпропено- вую кислоту следунлцей формулы

1419

н /соон

н

Антибиотик 2188 получают из куль- туральной жидкости штамма Panicillium rup,ulosum FERM ВР-142.

Штамм выделен из почвы, депонирован в Институте исследования ферментации Агентства промьшшенных наук и техники Министерства международной торговли и промьшшенности в Японии под номером 142 (FERM ВР-142).

Культурально-морфологические приз-

наки. Колонии обычно бархатистые при 30°С и шерстистые при , тусклого желтовато-зеленого цвета, светло-зеленого,светлого серовато-зеленого или зелено-серого в зависимости от типа культуральной среды, темные зеленые конидии, желтый или оранжево-желтый мицелий, обратная сторона колонии - желто-оракжевая или оранжево-красная. При 37°С рост отсутствует. На агаре солодового экстракта рост хороший На агаре картофельной декстрозы рост хороший. На агаре Сабуро рост хороший. На агаре овсяной муки рост хоро ШИ11. На глюкозном агаре с сухими дро;кжами рост хороший. На мукор-син- тетической среде рост ограниченньй. На агаре Чапека рост плохой.

Конидиофоры: растут прямо из стелющихся или вьющихся гифов и воздуш- ных гифов, 2,5-3,0 X 100-300 мкм, поверхность стенок гладкая или слегка грубая. Пенициллюс (пучок щетинок, кисть): симметрический кольчаторас- положенный. Метула: 2,5-3,5x7,5- -15 мкм, пучок из 3-6 метул. Фиалида типично ланцетовидная, 2,0-3,8x7,5- -13 мкм, в скоплениях из 2-6 элементов в мутовке. Конидии: эллиптические, 2, 5-3x3-3,8 мкм, зеленые,гладкие стенки, спутанные или параллельные цепи.

Физиолого-биохимические признаки. Растет при 10-35°С, оптимум роста

10

15

25

. 195212

при 20-30°С. Утилизирует в качестве источника углерода глюкозу, мальтозу, декстрин, крахмал, лактозу, сахарозу, глицерин. Утилизирует в качестве источника азота пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, соевую муку, муку земляного ореха, отбросы семян хлопка, жидкую кукурузную вытяжку, рисовые отруби, неорганический азот.

Продукт метаболизма штамма - антибиотик 2188 проявляет антибактериальную активность против различных грам- положительных и грамотрицательных бактерий, не проявляет острой токсичности по отношению к мышам при внутри- брюшинном введении в количестве 100 мг/кг.

Пример 1. Культура штамма Penicilliura rugulosum FERM ВР-142 с косого агара инокулируют в 100 мл среды Беннета (0,1% дрожжевого экстракта, 0,1% говяжьего экстракта, 0,2% N.Z. амина типа-А и 1% глюкозы, рН 7,2) в 300-миллилитровой колбе Эрленмейера. 50 колб

20

30

35

. 40

д5 ,,

50

с культуральной средой инкубируют при 248 С в течение 72 ч на вращающемся встряхи- вателе со скоростью 180 об/мин.

5 л полученной культуры инокули-, руют в 100 л стерилизованной среды в 200-литровом ферментере при 24 С в течение 60 ч при аэрации со скоростью 50 л/мин и перемешивании при 200 об/мин. Состав питательной среды, %: растворимый крахмал 1,5; глицерин 1,5; отходы семян хлопка 1,0; соевая мука 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; КгНР04 0,7; MgS04 7H,jO 0,05; 0,001; пеногаситель (А,ЦЕКАНОЛ G 126, Асахи Денка Когио К.К.) 0,1.

Всю культуру (100 л) пропускают через Шаплес (тип ГР-U 122-1, Томое Индижиниринг Ко.) и Делабал (тип ВРР X 309-355-60, Швеция) для удаления осадка мицелия. Прозрачный или чистый плавающий сверху слой доводят до рН 4 с помощью соляной кислоты и экстрагируют пятой частью по объему этилацетата с использованием непре- рывнодействующего центробежного устройства для экстракции (тип С- 1333, фирма Хитачи Лтд). Экстракт концентрируют с помощью конденсатора, и концентрат затем подвергают обратной экстракции водным 1%-ным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу

1419521

ловолят до рН 4,0 голяиой кислотом и экстрагируют этилацетятом. Экстракт сушат над безнолньм сульфатом натрия

и упаривают при температуре менее 40°С под вакуумом для получения сырого (неоч1С (енрюго) продукта.

Неочшцеиньп продукт пропускают через колонку с активированным углем, помещенным на верхнюю часть колонки (диаметром 4 см и высотой 50 см), заполненной силикагелем (ВАКОГЕЛЬ Q 23, Вако Кемикалэ Ко.), и проявляют смесью этилацетата и хлороформа (1:19 по объему) для элюирования активной фракции, к которой затем добавляют н-гексан. Получают 3 г белого порошка.

Полученный продукт имеет следующие физико-химические свойства.

Найдено,%: С 56,35; Н 3,49; N 7,34; О 32,82.

С,Н-,КО (моль.м. 193).

Т.пл. 135-136°С (разложение),удельное вращение ot j, -128,8 (с 1,0% в этилацетате).

УФ-спектр, Т (метаноп). 215 нм (t 14378).

ИК-спектр (KRr): 3450; 3000; 2150; 1700; 1665; 1425; 1330; 1090; 980; 900; 875.

ЯРМ-спектр (дейтерированный ацетон) S , М.Д.: 2,55 (д.д.,1Н. Г 16, Г 1,0); 3,05 (д.д., 1Н, Г 16 Г 0,5); 3,98 (д. 111, Г 1,0); 4,45 (д. 1Н, Г 0,5); 6,11 (д. 1Н, Г 16); 6,71 (д. 1Н, Г 16).

СЯМР-сиектр(дейтерированньп1 ме- м,д.: 168,Uc); 165,1(с);

Пример 2. Пять колб Эрлен- мейера емкостью по 300 мл, содержащих соответственно 100 мл среды с рН 7,2, которая включает 1% глюкозы, 0,1Z дрожжевого экстракта, 0,1% говяжьего экстракта и 0,2% полипептона, стерили зуют под давлением. Споры из культуры косого агара плесени ииокулируют

10 в среду в колбах и культивируют при 26 С в течение 70 ч при встряхивании со скоростью 180 об/мин. Полученную культуру (500 мл) инокулируют в 15 л стерилизованной среды с рН 7,0 в

15 30-литровом ферментере и культивируют при 26 С в течение 60 ч при аэрировании очищенныг- воздухом со скоростью 15 л/мин и перемешивании при 300 об/мин. Состав стерилизованной

20 среды следующи1 1(,%: нитрат натрия

0,3; 0,1; гептагидрат сульфата магния 0,05; хлористый калий 0,05; гептагидрат сульфата железа (II) 0,001; сахароза 3; дрожжевой экс

25 тракт 1; пеногаситель (АДЕКАНОЛ ZG 109) 0,1.

Полученную в результате культуру фильтруют с использованием в качест30

ве фильтровального средства Целита 545. Фильтрат адсорбируют на колонке диаметром А см и высотой 50 см, заполненной смолой Лиапон HP 20, промывают водой и злюирутот 60%-ным метано- 35 лом. Элюат кон,ентрируют в вакууме при температуре менее 40 С. Концентрированный материал экстрагируют этилацетатом, и экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее кон45

танол) 5

141,9(д); 125,8(д); 66,4(д); 66,1(д); 40 центрируют под вакуумом при темпера64,9(с); 62,5(с); 36,6(т).туре менее 40°С.

Продукт растворим в метаноле, эта- Полученный жидкий материал пропус- ноле, ацетоне, этилацетате, хлороформе и бензоле, нерастворим в гексане и петролейном эфире.

Тонкослойная хроматография с использованием си-пикагеля: только одно пятно при ,62 п смеси хлороформ- этилацетат-уксусная кислота (10:10:1); R,0,44 в смеси хлороформ-этилацетат- gg Колонку проявляют смесью этилацетат- уксусная кислота (10:10:0,2); R хлороформ (1:19 по объему) дня элюи- 0,79 в смеси н-бутанол-уксус.ная кислота - вода (4:1:1).

кают через колонку (диаметр 1,5 см, высота 30 см), запоп;;енную активированным угпс:-. Актив }гую фракцию концентрируют в вакууме, концентриро ванный материал наносят на колонку (20 X 300 мг-О из силикзгеля (ВАКОГЕЛЬ С 200) и промывают хлороформом.

рования активной фракции, к которой добавляют н-гексан. Получают 200 мг белого порошка. Полученный продукт проявляет те же физико-хугмические и биологические свойства, что и продукт по примеру 1.

Реверсиврьчя тонкослойная хроматография с КС-18: только одно пятно при ,86 в смеси метанол-вода (4:1); ,94 в смеси пропанол- вода (4 : 1).

Пример 2. Пять колб Эрлен- мейера емкостью по 300 мл, содержащих, соответственно 100 мл среды с рН 7,2, которая включает 1% глюкозы, 0,1Z дрожжевого экстракта, 0,1% говяжьего экстракта и 0,2% полипептона, стерилизуют под давлением. Споры из культуры косого агара плесени ииокулируют

в среду в колбах и культивируют при 26 С в течение 70 ч при встряхивании со скоростью 180 об/мин. Полученную культуру (500 мл) инокулируют в 15 л стерилизованной среды с рН 7,0 в

30-литровом ферментере и культивируют при 26 С в течение 60 ч при аэрировании очищенныг- воздухом со скоростью 15 л/мин и перемешивании при 300 об/мин. Состав стерилизованной

среды следующи1 1(,%: нитрат натрия

0,3; 0,1; гептагидрат сульфата магния 0,05; хлористый калий 0,05; гептагидрат сульфата железа (II) 0,001; сахароза 3; дрожжевой экстракт 1; пеногаситель (АДЕКАНОЛ ZG 109) 0,1.

Полученную в результате культуру фильтруют с использованием в качест

ве фильтровального средства Целита 545. Фильтрат адсорбируют на колонке диаметром А см и высотой 50 см, заполненной смолой Лиапон HP 20, промывают водой и злюирутот 60%-ным метано- лом. Элюат кон,ентрируют в вакууме при температуре менее 40 С. Концентрированный материал экстрагируют этилацетатом, и экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее кон

Полученный жидкий материал пропус-

Колонку проявляют смесью этилацетат- хлороформ (1:19 по объему) дня элюи-

кают через колонку (диаметр 1,5 см, высота 30 см), запоп;;енную активированным угпс:-. Актив }гую фракцию концентрируют в вакууме, концентриро ванный материал наносят на колонку (20 X 300 мг-О из силикзгеля (ВАКОГЕЛЬ С 200) и промывают хлороформом.

Колонку проявляют смесью этилацетат- хлороформ (1:19 по объему) дня элюи-

рования активной фракции, к которой добавляют н-гексан. Получают 200 мг белого порошка. Полученный продукт проявляет те же физико-хугмические и биологические свойства, что и продукт по примеру 1.

Таким образом, использование изобретения позволит получать новый антибиотик широкого анти14икробного спектра действия.

Формула изобретения

1. Способ полутния антибиотика 2188 общей формулы

н

соон

Н

заключаквдийся в том, что штамм Peni- cillium rugulosum FERM ВР-142 куль

тивируют в питательной среде, содержащей органические источники азота и углерода, минеральные соли и пено- гаситель, в условиях аэрации и перемешивания, экстрагируют отделеиньй фильтрат культуральной жидкости этил- ацетатом с последующим пропусканием экстракта через колонку с активированным углем, элюированием смесью этилацетата и хлороформа и кристаллизацией целевого продукта в присутствии в элюате н-гексана.

2. Штамм плесневого гриба Penicil- lium rugulosura FERM ВР-142, исполь- зуемьй для получения антибиотика 2188.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Штамм-продуцент антибиотика 2188, поддерживаемый на косом агаре, инокулируют в посевной, а затем в ферментационной среде, содержащей органические источяики азота,источник углерода, минеральные соли и пеногаситель, в условиях аэрации и перемешивания при 24 С. Культураль- ную жидкость освобождают от мицелия; фильтрат культуральной жидкости экстрагируют этилацетатом. Получеиньй экстракт хромятографируют на колонке с активированным углем и элюируют целевой продукт смесью этилацетата и хлороформа. В элюат добавляют н- гексан и кристаллизуют. Для осуществления способа используют штамм плесневого гриба Penicillium rugulosum FERM ВР-142. 2 с.п.ф.-лы. S СО