Конидии собраны в цепочки, тогда, как ячеистые суспензии, полученные с поверхностей таких культур, наблюдаемые под микроскопом, содержат много вытянутых элипсоидальных (0,8-1,2 х X ,0-6,8 мм и элипсоидальных 0,81,2 X 1,0-2,0 мм7 тел, похожих на ар роспоры. Штамм хорошо растет в различных средах, причем вегетативный мицелий бесцветный, бледно-желтый в начальных стадиях и светло-желтоватый до желтоватого цвета дубовой коры в последних стадиях. Штамм дает растворимые пигменты от желтых до желтоватых тонов дубовой коры в различных таксономических средах, . Агар нитрата сахарозы. Рост буйный,. Субстратный мицелий ОТ цвета желтой дыни до цвета янтаря Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует или он бледно-желтый, рыжевато-коричневый . Глюкозо-аспарагиновый агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета ноготков до желтого. Во душный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент - желтый. . Крахмальный агар. Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости. Воздушный мице лий изобильней, цвета слоновой кости Растворимый пигмент отсутствует. Питательный агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого. Воздушный мицелий скудный, белый.Рас воримый пигмент отсутствует. Агар с малатом кальция. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до цвета пше ницы. Воздушный мицелий средний, бел го цвета до цвета слоновой кости.Рас воримый пигмент отсутствует. Дрожжевой агар с солодом. Рост средний. Субстратный мицелий от янтарного до желтого. Воздушный мицелий средний, белый до цвета елоновой кости. Растворимый пигмент отсутствует. Агар с нитратом глицерина. Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости, коремия подобн образованным телам. Воздушный мицели средний, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Агар аспарагина с глицерином. Рост средний, субстратный мицелий цвета слоновой кости, коремия подобна образованным телам. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Агар с овсянкой. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого, коремия подобна образованным телам. Воздушный мицелий скудный, белый до светло-желтого. Растворимый пигмент отсутствует. Экстракт пептонных дрожжей в крепком агаре. Рост средний. Субстратный мицелий желтый. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент желтый. Тирозиновый агар. Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до цвета желтой дыни. Воздушный мицелий средний, от белого цвета до цвета слоновой кости. Растворимый пигмент - цвет верблюда, Физиологические характеристики. Растет при . Оптимальная температура для роста 20-35 С. Желатину разжижает, крахмал гидролизует. Молоко пентонизирует, но не коагулирует. Казеин разлагает. Нитраты сжижает, Меланоидных пигментов не образует. Тирозин разлагает, Ксантин и гипоксантин не разлагает. Толерантность лизима положительная. Толерантность хлорида натрия - 2%, Очень хорошо усваивает ксилозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, хорошо усваивает арабинозу, галактозу, рамнозу, трегалозу, мелибиозу, маннитин, крахмал. Слабо усваивает лактозу, инозитин, сорбитин, глицерин. Окрашивание по Граму вегетативного мицелия штамма - положительное. Среда, употребляемая для культивирования штамма, способного производить метанзинол, метанацин или пропионат метанзинола может быть жидкой и твердой. В последнем случае она должна содержать питательную среду, которую штамм может утилизировать, хотя жидкая средд предпочтительна для высокопродуктивных процессов, и, как было найдено, среда является мезоформой, тогда как обнаруженные пятна со.ответствовали галактозе и арабинозе. Среда содержит источники углерода и азота, которые штаммом № С-15003 могут ассимилироваться и дигестироват ся, неорганический материал, следы питательной среды и т.д. В качестве источников углерода могут быть глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, декстрин, крахмал, глицерин, маннитин сорбитин и т.д., жиры и масла (например, соевое масло, свиное сало, куриный жир и т.д.) и другие. Источниками азота могут быть, например, экстракт мяса, экстракт крахмала, сухой крахмал, соевая мука, злаки, погруженные в жидкость, пептон, казеин, мука из семян хлопка, меласса, мочевина, соли аммония (например, сульфат, хлорид, нитрат, ацетат аммония и т.д.) и другие. Среда может также содержать соли натрия, калия, кальция, магния и т.д соли железа, марганца, цинка, кобальта, никеля и т.д., соли фосфорной борной кислот и т.д., соли органических кислот, такие, как ацетаты и пропионаты. Среда может также содержать как добавки различные аминокислоты (например, глутаминовую, аспарагиновую кислоты, аланин, глицин, лизин, мети Ьнин, пролин, и т,п.) пептиды например, дипептиды, трипептиды и т.д.) витамины например, . никотиновую кислоту, Cj2, С,,Е и т.д.), нуклеиновые кислоты (например, пурин, пирамидин и их производные и т.д.). Для создания определенной величины рН среды добавляют органические или неорганические кислоты, и елочи, буферы и т.п. Растворимые количества масел, жиров, поверхностно-активных веществ и т.д. могут также добавляться в качестве антивспенивателей. Культивирование проводят при стационарных, колебательных, погружных, аэробных и других условиях. Для высокопродуктивных процессов погружное аэробное культивирование является предпочтительным. Культивирование зависит от условий и состава среды, штамма, способа культивировайия и других факторов, причем предпоч тительно проводят инкубирование при 25-30 С с начальной величиной рН в области 7. В промежуточной стадии культивирования желательна температура 23-30 С с начальным рН 6,. Так как время инкубирования меняется в зависимости от упомянутых факторов, желательно продолжать инкубирование до тех пор, пока титр предлагаемого антибиотика не станет максимальным. При культивировании в условиях аэробного погружения в жидкую среду необходимый интервал времени обычно составляет 8-1 ч. Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол получается и аккумулируется в равнодействующем культивированном бульоне как внеклеточно, так и внутриклеточно. Ни одно из этих веществ не показывает ясную антибиотическую активность, поэтому они были обнаружены с помощью тонкослойной хроматографии. Ферментный бульон разлагается в клетках.и фильтре с помощью фильтрации или центрифугирования и фильтрат экстрагируют тем же объемом этилацетата. К клеткам добавляют такое же количество 70 -ндго раствора ацетона в воде, как к фильтрату, и после перемешивания в течение часа при суспензию фильтруют. Ацетон удаляют из фильтрата и водный фильтрат экстрагируют этилацетатом. Каждый из экстрактов концентрируют до 1/100 по объему и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикатной гелево-стеклянной пластине (растворитель хлороформ метанол 9:1. Об активности судят по интенсивности пятенj определяемых иррадиацией с ультрафиолетовым светом при 2537 А. Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол, которые, таким обра-j зом получают в культивированном , дипофильны и нейтральны, они могут быть легко регенерированы путем сепарации и очистки, которые осуществляют обычно для получения таких микробиологических метаболитов. Например, может быть осуществлена операция, которая использует разницу в растворимости между антибиотиком и примесями, способы, которые используют фракционную абсорбционную эффективность различных абсорбентов, , как активизированный уголь,микропористые неионные смолы, силикагель, алюминий и т.д., процесс удаления примесей посредством ионообменных смол и т.д. Эти способы могут применяться по отдельности, в комбинации друг с другом, однократно или многократно.
Метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола получают в фильтрате, антибиотики отделяют и очищают посредством абсорбентов. Антибиотик получают или непосредственно, или после эк- 5 рой
стракции растворителем в случае фильтрата, или после экстракции растворителем в случае микробных клеток. Экстракция растворителем может быть осуществлена из культивированного бульо- О на для отделения клеток и из фильтра та, полученного после фильтрации, центрифугирования или других процессов. Чтобы экстрагировать фильтрат и клетки независимо друг от друга могут быть использованы растворители для экстракции фильтрата - водоэмуль сионные органические растворители такие, как эфиры жирных кислот, например этилацетат и амилацетат, спир ты, например бутанол, галогенированныегидрокарбонаты, например хлороформ, кетоны, например метил-изобутилкетон. Экстракцию производят при рН, бли ком к нейтральному. Предпочтительно культивированную жидкость, доведенную до рН 7, экстрагировать этилацет том. Экстракт промывают водой и концентрируют под пониженным давлением. Затем неполярный растворитель такой, как петролейный эфир или гексан добавляют к концентрату, и сырой продукт 1, содержащий активные соеди нения, регенерируется. Так как на тонкослойной хроматограмме обнаруживается ряд других пятен, кроме метанацина, метанзинола, пропионата мета зинола, то продукт 1 подвергают очист-ло Для очистки используют ряд методов, например абсорбционную хроматографию, с применением одного из общепринятых абсорбентов таких, как силикагель, алюминий, макропористая неионная смола. Для очистки сырого про)цукта 1 особенно подходит силикагель Затем петролейный эфир и гексан используют с добавлением полярных растворителей таких, как этилацетат, ацетон, этанол или метанол, Силикагель используют как носитель, хроматографическую колонку заполняют последовательно возрастающими отношениями гексана к этилацетату. Пробу исследуют с помощью тонкослойной хроматографии, и фракции, содержащие активные
ингредиенты, добирают и концентрируют под пониженным давлением. Затем петролейный эфир или гексан добавляют к концентрату, при этом получают сысодержит еще примеси, его очищают. На пример, продукт 11 может быть очищен с помощью второй колонки с сияйкагелем, с.использованием дифференциальпродукт П. Так как этот продукт ной системы растворителей. Система растворителей для этой цели может состоять из галогенированного углеводорода такого, как дихяорметан или хлороформ, с добавлением полярного растворителя такого, как спирт, например этанол или метанол, кетон, например ацетон или метилэтилкетон и т.п. Таким образом выделяют метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола. Чтобы система растворителей для первой и второй колонок с силикагелем могла быть регенерирована, обычные органические растворители при необходимости могут использоваться совместно с упомянутыми. Когда макропористая абсорбционная смола используется как средство для очистки сырого продукта 11, то очистку метанацина, метанзинола или пропионата метанзинола выполняют в смеси воды с низшим спиртом, низшим кетоном или эфиром. Низшим спиртом может, например, быть метанол, этанол, пропанол или бутанол и низшими кетонами могут быть, например ацетон или метилэтилкетон. Эфиром может, например, быть этилацетат. В типичной операции сырой продукт 11 растворяют в 60%-ном растворе метанола в воде и абсорбируют на колонке DIaion-HRIO. Колонку промывают , а затем раствором метанола в ваде. Таким образом метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол выделяют из колонки, Фракции, содержащие указанные компоненты, объединяют и концентрируют под пониженным давлением. К сухому продукту добавляют 5-8 объемов этилсмесь отстаивают. Затем ацетата, кристаллы метанацина, пропионата метанзинола и метанзинола отделяют с помощью абсорбентов. Так, используя силикагель или макропористую неионную tuony, а в качестве абсорбента - рас ворители, выделяют описанные соединения. Когда, например, используют силикагель, топрименяют гексан, этил99387t61.0
ацетат или смесь хлороформ-метанол, пользовании 60% метанол-вода и 95 при этом выделяют пропионат метанзино- метанол-вода с добавкой 5 хлорида ла иметанацин. После обнаружения с по- натрия метанацин и пропионат метанмощью тонкослойной хроматографии фрак- зинола появляются в упомянутом порядции концентрируют под пониженным дав- ке. После взятия пробы и определения лением, и этилацетат добавляют к кон- с помощью тонкослойной хроматографии центрату. Таким образом, соответству- каждую группу активных фракций конющее соединение может быть получено центрируют под пониженным давлением и в виде кристаллов,кристаллизуют из этилацетата. Выделен,10 ные кристаллы включают этилацетат
Когда применяют макропористую как растворитель кристаллизации и поснеионную абсорбентную смолу, то может ле сушки над пятиокисью фосфора при быть использован растворитель с раз- в течение 8 ч имеют физические личным соотношением спирта, кетона и химические свойства, представленные или эфира и воды. Например, при ис- is в таблице.
Z2.°92
К) 121 + (d) 127-10 + 10 (,35; сне Ц) (,25;СНСу
W 3l3-l(f ,22; СНСЬ) Кислота,нейтЛигюфил и Липофил и нейтнейтральное ральное вещество ральная или основная вещество
Цветные реек- Положительции |р-ция
ная
Драгендорфа
Реакция Бель- Положител.ь- Положительная
ная
штейна Приведенные данные элементного анализа, специфического вращения, УФ-, ИК- и масс-спектров находятся в хорошем соответствии с данными для метанацина. и м е р 1, Метанзинол, метанацин и пропионат метанзинола - производные Нокардиа С-15003 (IFO 13726; FERM 3992; АТСС 31281), выращенные на дрожжевом экстракте солода в агаре, используют для прививки 200 ч ( по объему) ферментов, содержащих 40 об. ч семян, культивированных в среде (2 глюкозы, 3 раствора крахмалву муки сырых соевых бобов, 1% погруженных в жидкость злаков, 0,5 полипентона, 0,3 Nad, 0,5 CaCOj, рН 7,0). Культивированную среду инкубируют при 28°С в течение kQ ч до введения в колонку 0,5 об.ч. раствора, получен ного таким образом: из колонки помещают в 200 об.ч. фермента, содержащег kO об.ч. ферментной среды, состоящей из 5 декстрина, 3 зерна, погруженного в жидкость, 0,1 полипептона и 0-,5% СаСО при рН 7,0, и культивируют при 28С в течение 90 ч, чтобы получить культуру семян. Методом последовательного разбавле ния, используя в качестве исследуемого организма Тетрахимену пириформис V/и метанзинолпропионат как стандартный продукт, найдено, что названная культура имеет титр 25 мг/мл. Пример 2. 10 об.ч. культуры семян, полученных в примере 1, помещают 8 2000 об.ч. фермента, содержащего 50 об.ч. семян, культивирован ных в среде Атакой же, как упомянутая), и инкубируют при 28С в течени 48 ч. 500 об.ч. культуры переносят в сосуд из стали емкостью 50000 об.ч..
Положительная
Положительная
Положительная Липофил и нейтральное веществосодержащий 30000 об,ч. семян, культивированных в среде, и культивируют при 28°С, аэрации (30000 об.ч./мин, перемешивании г.р. т. (1/2ДТ) и внутреннем давлении (1 кг/см) для получения культуры семян. Эту культуру используют для посева 200000 об.ч. в сосуде из стали, содержащем 100000 об.ч. ферментативной среды, подобной среде, использованной в примере 1, при скорости инокуляции 10%. Инокуляционную среду инкубируют при , аэрации (100000 об.ч. /мин), перемешивании 200 г.р. ум ,(1/2ДТ)3 и внутреннем давлении (,1 кг/см) в течение 90 ч. Проводят ту же операцию, что и в примере 1. Полученная культура имеет титр 25 мг/мл. К 90000 об.ч. полученной культуры добавляют 2000 ч. Гифло-суперцела Р и, после перемешивания, смесь фильтруют на фильтр-прессе, чтобы получить 85000 об.ч. фильтрата и 32000 ч. влажных клеток. Фильтрат 85000 об.ч. перемешивают и экстрагируют 30000 об.ч. этилацетата. Эту операцию повторяют снова. Осадки этилацетата объединяют, промывают дважды 30000 об.ч. воды, сушат путем добавления 500 ч. обезвоженного сульфата натрия и концентрируют под пониженным давлением до 200 об.ч. Петролейный эфир добавляют к концентрату и проводят осаждение и фильтрование. Полученный сырой продукт 1 перемешивают со 100 об.ч. этилацетата, и раствор фильтруют. Фильтрат смешивают с 10 ч. силикагеля и этилацетат удаляют под пониженным давлением. Остаток помещают на верх колонки с си лика гелем kOO об. ч.) Раствор удаляют об.ч. гексана, 500 o6.4i смеси гексанэтилацетат (3:U, 139 500 об.ч, смеси гексан-этилацетат (1:1), 500 об.ч. смеси гексан-этилаце тат (1:3, 500 об.ч. этилацетат, 1000 об.ч. смеси этилацетат-метанол (50:1) и 1000 об.ч. смеси этилацетатметанол (25:1) собранными во фракции по 100 об.ч, Одну часть объема каждой фракции концентрируют сушкой, и 0,1 об.ч. этилацетата добавляют в концентрат. Смесь дает пятно на расстоянии 2,5 см от дна острия сигмкагелевой стеклянной пластины и растет,примерно, до 17 см с растворимой системой этилрцетат-метанол (19:1). После этого Производят определение в ультрафиолет товом свете (2537 А). Активные фракции f 25-30 Rf 0,58-0,63 и фракции f Rf 0,25-0,30 собирают и концентрируют под Пониженным давлением, примерно до 20 об.ч. К этим концентратам добавляют 150 об.ч. петролейного эфира для получения 5 ч. сырого продукта 1 и 2 ч. сырого метанзинола. В 10 об.ч. этилацетата растворяют 0,5 ч. полученного сырого продукта 1 и раствор хорошо перемешивают с ч. силикагеля. Этилацетат удаляют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 300 об.ч. силикагеля, и колонку вначале промывают 500 об.ч. хлороформа и затем обрабатывают 500 об.ч. смеси хлороформ-метанол (50:1), 500 об.ч. смеси хлороформ - метанол (20:1) и 500 об.ч. сме си хлороформ - метанол (10:1). Раствор собирают фракц1;1ями по 25 об.ч. 0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют при пониженном давлении. К кон центрату добавляют 0,05 об.ч. этилацетата, и смесь в виде образца подвергают анализу методом тонкослойной хроматографии (система .хлороформ метанол 9:1). Фракцию № 0, абсорбированную при 2537А в зоне R 0,,50, собирают и концентрируют сушкой под пониженным давлением. К осадку добавляют 0,5 об этилацетата, и смесь отстаивают, затем получают 0,05 ч. смешанных кристаллов метанацина и пропионата метанзинола. 0,05 ч. смешанных кристаллов метанацина растворяют в 5 об.ч. метанола следовавшего за добавлением 0,1 ч. хлорида натрия и 5 об.ч. воды. Колонку заполняют 200 об.ч. Diaion HP-10 промывают 600 об.ч. 502; метанол-вод 61 содержащих 5 /МаС1. Пробу раствора, приготовленного указанным способом, пропускают через колонку и растворение доводят до конца с использованием 1500 об.ч. 60 метанола - воды,, содержащих 5% NaC:1 и 1500 об.ч..95% метанола - воды. Раствор собирают в фракции по 15 об.ч., и каждую фракцию исследуют тонкослойной хроматографией. Фракции 130-135 содержат метаноцин, и фракции 138-1 2 содержат пропионат метанзинола. Каждую группу фракций концентрируют и растворяют добавлением 30 мл воды и 50 мл этилацетата. Раствор перемешивают в разделительйой воронке, водный слой отделяют, и после двух- кратной промывки 30 мл воды осадок этилацетата высушивают над безводным сульфатом натрия, концентрируют и отстаивают. Описанным способом получают Кристаллы из каждой группы фракций. : Кристаллы собирают с помощью фильтрации и сушки. Содержание метанацина 0,013 ч., пропионата метанзинола 0,025 ч. В 3 об.ч. этилацетата растворяют 0,2 ч. сырого метанзинола, полученного описанным способом, и раствор хорошо перемешивают с 0,5 ч. силикагеля. Этилацетат удаляют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 80 об.ч. силикагеля, и колонку сначала промывают 150 об.ч. затем 150 об.ч. смеси хлороформ-метанол (50:1), 150 об.ч. меси хлороформ-метанол (20:1) и . ЗОО об.ч. смеси хлороформ-метанол (10:1). Раствор собирают во фракции по 10 об.ч. 0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют под пониженным давлением. К концентрату добавляют 0,05 об.ч. этилацетата, и смесь подвергают анализу с тонкослойной хроматографии (растворяющая система хлороформ - метанол 9:1). Фракции № 50-52 абсорбируют при 2537 А в зоне 0,33-0,38, собирают и концентрируют путем сушки под пониженным давлением. К осадку добавляют 0,5 об.ч. этилацетата, и смесь отстаивают, в результате чего получают 20 ч. кристаллов метанзинола. Пример 3. Путем перемешивания 32000 ч. клеток, полученных в примере 2, экстрагируют 50000 об.ч.
