Способ получения производных антибиотиков А-21978С, штамм стрептомицета SтRертомYсеS RoSeoSpoRUS, используемый для получения антибиотических веществ А-21978С Советский патент 1989 года по МПК C12P21/04 C12P21/04 C12R1/465 

4

ел IVD

4iik

00 4ib

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству антибиотиков о Цель изобретения - упрощение способа, а также создание нового штамма, пригодного для получения антибиотических веществ А-21978С. Штамм Streptomyces roseosporus NRRL , 15998 получен путем селекции из штамма NRRL 11379. При культивировании щтаммы продуцируют антибиотический комплекс А-21978С. При дополнитель-- ном введении в процессе ферментации метилолеата и соответствующей Cg-C,- алкановой кислоты или этилового эфира капроновой кислоты или соли аммония капроновой кислоты и каприловой кислоты получают целевой продукт - соответствующие производные антибиотиков А-21978С. 2 с. и 1 з.п. ф-лы. 4 табл. СО

СП

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству антибиотиков.

Цель изобретения - упрощение способа, а также создание нового штамма пригодного для получения антибиотических веществ А-21978С.

Штамм Streptomyces roseosporus А-21978,65 является мутантом штамма Str.roseosporus NRRL 11379, депонирован под номером NRRL 15998 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Споровые цепи содержат более 10 спор на цепь. Поверхность спор гладкая от продолговатых до овальных Спорофоры от прямых до извилистых. Размер спор 0,85x1,78 мкм (средний).

Морковные пробки: воздушный мицелий - рост хороший, цвет серый с алым, субстратный - рост стабильный, цвет коричневый. Растворимые пигмен- ты отсутствуют.

Картофельные пробки: воздушный мицелий - рост хороший, цвет серый с алым, субстратный мицелий - рост обильный, цвет коричневый. Раствори- мый пигмент темно-коричневого цвета.

YSP № 1: воздушный мицелий - рост посредственный, цвет (W)a белый (цве по Маег and Paul), субстратный мицелий - рост хороший, цвет (10А1) бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент отсутствует.

YSP № 2: воздушный мицелий обильный, (R) 5 с серо-желто-розовый, субстратный мицелий - обильный.(5D10 светлый красно-коричневый. Растворимый пигмент светло-коричневого цвета

У5Р № 3: ВОЗДУШР1ЫЙ мицелий посредственный, (W)a белый, субстратный мицелий посредственный, (10А2) блед- ный желто-розовый. Растворимый пигмент светло-коричневого цвета.

У8Р № 4: воздушный мицелий хороший, (W)b белый, субстратный мицелий хороший, (10В1) бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент светло-коричневого цвета

ySP № 5: воздушный мицелий посредственный, (W) 13Ьа пурпурно-белый, субстратный мицелий хороший, (377) серый желто-розовый. Растворимый пигмент серо-розового цвета.

ySP № 7: воздушный мицелий обильный, (R)5cb серый желто-розовый. Ра

о

5

0

5

п

.

5

0

0

5

створимый пигмент темно-коричневого цвета.

. Модифицированньй агар Беннета: субстратный мицелий плохо развит, бледно-желто-коричневый. Растворимый пигмент и воздушный мицелий от- сутс твуют.

Малат-кальциевый агар: воздушный мицелий не развит, субстратный мицелий посредственный, (7L12) красно-коричневый. Растворимый пигмент светло- коричневого цвета.

Агар Чапека: воздушный мицелий плохо развит, (W)a белый, субстратный мицелий плохо развит, беловатый. Растворимый мицелий отсутствует.

Агар Эмерсона: воздушный мицелий плохо развит, субстратный мицелий обильный, (). Растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозо-аспарагиновый агар: воздушный мицелий хороший (W) белый, субстратный мицелий хороший, (12В2) серо-желтый. Растворимый пигмент отсутствует.

Глицерин-глициновый агар: воздушный мицелий плохо развит, субстратный мицелий обильный, (8L12) темно- серый коричневый Растворимый пигмент коричневого цвета

Питательный агар: воздушный мицелий отсутствует, субстратный мицелий плохо развит, бледный желто-серый Растворимый пигмент отсутствует.

Агар на томатной пасте и овсяной муке: воздушный мицелий обильный, (R)5cb серо-желто-розовый, субстратный мицелий Обильный, (8L12) темно- серо-коричневый. Растворимый пигмент коричневого цвета.

Физиолого-биохимические свойства.

Из углеводов использует L-араби- нозу, D-фруктозу, D-галактозу, D-глю- козу, D-маннит, L-рамнозу, салицин, D-ксилозу, не усваивает i-инозит, D-рафинозу, сахарозу.

Меланоидные пигменты не образует. Желатин разжижает. Тирозиновая проба отрицательная Растет в присутствии 10% NaCl.

Снятое молоко - вызьшает слабый гидролиз. Крахмал гидролизует, нитраты в нитриты не восстанавливает.

Диапазон рН роста 5-11.

Температурный интервал роста 25 - .

Чувствителен к антибиотикам: эритромицину (15 мкг/диск), цефалоти- ну (30 мкг/диск), полимиксину В (300 ед/диск), стрептомицину (10 мкг/диск), тетрациклину (30 мкг /диск), ванкомицину (30 мкг/диск).

Штамм продуцирует антибиотические вещества А-21978С.

Использование штаммов Str.roseosp rus NRRL 15998 и NRRL 11379 иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Получение комплек са А-21978С.

Получают чистую культуру и поддерживают ее в первой фазе жидкого азота. StToToseosporus NRRL 15998, предварительно хранившийся в паровой фазе жидкого азота, применяют для инокулирования 50 мл вегетативной среды следукидего состава, %:

Соевый бульон

Trypticase . 3,0

Декстрин2,5Деионизированная вода94,5

Инокулированную среду инкубируют в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл при 30°С в течение 48 ч на встряхивающем аппарате, вращающемся посредством дуги диаметром 2 дюйма (51,4 мм) со скоростью 250 об/мин. Зрелую вегетативную культуру распределяют в многочисленные контейнеры (0,5 МП/контейнер) и хранят в парах жидкого азота

1 мл культуры, хранящейся в жидком азоте, применяют для инокулирования 80 мл вьшеописанной вегетативной среды. Инокулированную вегетативную среду инкубируют в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл при 30°С в течение 48 ч на встряхивающем аппарате, вращающемся со скоростью 250 об/мин

10 мл этой культуры используют для инокулирования 450 мл среды для второй стадии вегетативного выращивания, имеющей такой же состав, как вышеописанная первичная вегетативная среда Среду для второй стадии инкубируют в двухлитровой колбе Эрленмейера в течение 24 ч при 30°С на встряхивающем аппарате, вращающемся со скоростью 250 об/мин.

1 л вегетативной культуры второй стадии используют для инокулирования 39 л стерильной среды следукяцего состава, %:

0

o

0

Соевая мука О,5 Дрожжевой экстракт0,5 Глюконат кальция1,0 Хлорид калия 0,02 MgS04-7H20 0,02 FeS04 7Н20 0,0004 Sag 471 (противо- вспениватель) 0,03 Вода . 97,9296 Следовые минералы (хлорид калия, MgS04- 7Н20, FeSO 7Н20) приготов- 5 лены следующим образом: FeSO. 7Н.О (7,6 г) растворяют в концентрированной соляной кислоте (76 мл) Добавляют MgSO 7H.jO (380 г), KCl (380 г) и деионизированную воду до получения общего объема 3800 мл о Для обеспечения необходимого количества конкретных минералов применяют 80 мл раствора на 39 л инокулята третичной стадии развития.

Инокулированную среду инкубируют в течение 24 ч в сосуде из нержавеющей стали при . босуд аэрируют стерильным воздухом при расходе воздуха 0,85 объем/объем/мин и переме- 0 шивают обычной мешалкой со скоростью 350-450 об/мин.

1 л инкубированного инокулята третьей стадии развития применяют для инокулирования 1I9 л стерильной g продуцирующей среды следуннцего состава, %:

Соевая мука 2,2 Fe(NH4)iS04 6Н20 0,066 Декстроза,0,825

Sag 4710,022

Картофельный

декстрин3,3

Меласса (темное- вино)0,275

5 Водопроводная

вода93,312

5

рН доводят до 7,0 после добавления первых двух ингредиентов и 50 еще раз после добавления всех ингредиентов, непосредственно перед стерилизацией

Инокулированную продуцирующую gg среду инкубируют в течение 6 дней в сосуде из нержавеющей стали при 20°С и аэрации стерильным воздухом с расходом воздуха 0,5 объем/объем мин. Среду перемешивают обычной мешалкой

со скоростью 250 об/мин в течение первых 15 ч и со скоростью 350 об/мин по истечении 15ч. рН поддерживают равным или более 6,5 путем добавлеHO G

Увеличенное получементационную среду добавляют стериль-. ный раствор, состоящий из 25% (объем/ /объем) нонановой кислоты и 75% меПримерние A-21978Cj.

Первичная, вторичная и третичная стадии выращивания проведены так, как ЗО тилолеата, с расходом 0,13 мл на 1 л описано в примере 1 ,ферментационного бульона в 1 ч и подСтадия продуцирования инициирова- держивают такой расход до окончания на так, как описано в примере 1, за ферментации через 144 ч. Выход комп- тем исключением, что, начиная с 28 ч, лекса А-21978С составляет 0,821 г на в ферментационную среду добавляют сте- 1 л бульона - повышение на 293 % по рильный раствор, состоящий из 50% сравнению с выходом, полученным в - (объем-объем) каприловой (октановой)

примере 1. Фактор А-21978Сд (формула (1 :К нонаноил ) составляет 10% от общего количества комплекса А-21978С, полученного по этому способу, в комплексе А-21978С, полученном по методу, описанному в примере 1, фактор А-21978С9 не обнаружен

кислоты и метилолеата, с расходом 0,13 мл на 1 л ферментационного бульона в 1 ч и поддерживают такой расход до окончания ферментации через 144 ч. Выход комплекса А-21978С составляет 1,255 г на 1 л бульона, т.е. на 455 % больше, чем выход в примере 1. Фактор A-21978Cj (соединение формулы I., в которой R представляет собой октано- ил) составляет 9% от общего количества комплекса А-21978С, полученного по этому способу, в комплексе, полученном по способу, описанному в приме .ре 1, А-21978С не обнаружен.

П р и м е р 3, Увеличенное получение А-21978С9.

Первичная, вторичная и третичная стадии развития инокулита выполнены так, как о писано в примере 1 . Стадия продуцирования инициирована так, как описано в примере 1, за тем исключением, что, начиная с 28 ч, в фер

ния раствора гидроксида аммония. Выход комплекса А-21978С формулы I составляет 0,282 г на 1 л бульона по окончании .ферментации

/

I Ч/

N 1 Н

/Ч,

ментационную среду добавляют стериль-. ный раствор, состоящий из 25% (объем/ /объем) нонановой кислоты и 75% метилолеата, с расходом 0,13 мл на 1 л ферментационного бульона в 1 ч и под держивают такой расход до окончания ферментации через 144 ч. Выход комп- лекса А-21978С составляет 0,821 г на 1 л бульона - повышение на 293 % по сравнению с выходом, полученным в -

40 д

примере 1. Фактор А-21978Сд (формула (1 :К нонаноил ) составляет 10% от общего количества комплекса А-21978С, полученного по этому способу, в комплексе А-21978С, полученном по методу описанному в примере 1, фактор А-21978С9 не обнаружен

П р и м е р 4о Увеличенное полу- 45 чение фактора А-21978С (формула I R - н-деканоил)..

Первичная и вторичная стадии веге- татизшого выращивания выполнены так, как описано в примере 1. На третичной стадии применяют 800 мл вторичной культуры инокулята для инокули- рования 950 л стерильной среды для третичного выр.ащивания инокулята следующего состава,%:

Декстроза2,0

Карбонат кальция0,2 Соевая мука 2,0

Дрожжевой

экстрактО,1

КС10,02

MgSO, 7Н20 0,02 FeS04 lHjO 0,0004 Sag 471 (проти- воспениватель) 0,02 Вода95,6396

Раствор следовых минералов (КС1, MgS04- 7HiO, FeS04 7H,jO) приготовлен так же, как описано в примере 1. Инокулированную среду инкубируют в течение 24 ч при в сосуде из нержавеющей стали. Сосуд аэрируют стерильным воздухом с расходом воздуха 0,8 объем/объем/мин и перемешивают обычной мешалкой. 1 л этого ино- кулята третичной стадии применяют дл инокулирования 119л среды на стадии продуцирования, имеющей состав, приведенный в примере 1. Стадию продуцирования тоже иницируют, как описано примере 1, за тем исключением, что, начиная с 28 ч, в ферментационную- среду подают стерильный раствор, состоящий из 50% (объем/объем) капроновой (декановой) кислоты и 50% ме- тилолеата, при расходе 0,26 мл/л ферментационного бульона в 1 ч и поддерживают такой расход до окончания процесса ферментации через 283 ч Выход комплекса А-21978С составляет 1,94 г на 1 л бульона, это на 687 % больше выхода, достигнутого в примере 1. Концентрация фактора A-21978Cfo (формула I:R - н-деканоил) составляет 1,63 г на 1 л или 84 % от общего количества комплекса А-21978С. Это на 13583 % больше количества А-219780, , полученного по методике, описанной в примере 1 .

П р и м е р 5. Вариант способа увеличенного получения A-21978C,j .

Первичная, вторичная и третичная стадии развития инокулята выполнены так же, как описано в примере 1. Стадия продуцирования инициирована так же, как описано в примере 1, за тем исключением, что, начиная с 28 ч, в ферментационную среду добавляют стерильный раствор, состоящий из 25% (объем/объем ) этилового (сложного) эфира капроновой кислоты (этилкапра- та ) и 75% метилолеата, при расходе 0,13 мл/л ферментационного бульона в 1 ч и поддерживают такой расход до окончания процесса ферментации через 144 ч. Выход комплекса А-21978С составляет 1,022 г/л увеличение на 362 % по сравнению с выходом, достигнутым в примере 1. Концентрация фактора А-21978С о составляет 0,202 г/л или 20% от общего количества комплекса,, А-21978С.

П р и м е р 6. Ва:риант способа увеличенного получения А-21978С, .

Первичную и вторичную стадии вегетативного выращивания проводят так, как описано в примере 1. Третичную стадию выраи1ивания инокулята проводят так, как описано в примере 4, за

тем исключением, что обьем среды составляет 1900 л и продолжительность стадии увеличена до 48 ч. Скорость аэрации 0,3 о&,/об. в 1 мин в течение первых 24 ч, 0,45 об./об. в 1 мин в

течение 24-40 ч и 0,90 об./об. в 1 мин в течение 40-48 ч. Стадия продуцирования инициирована так, как описано в примере 1. После 23 ч в ферментационную среду вводят 0,004% дрожжевого экстракта, а начиная с 36 ч - раствор глицерола и деканоата аммония при расходе 0,84 мл/л ферментационного бульона в 1 ч. Питательный раствор содержит глицерин (3600 г), деионизированную воду (9000 мл), капроновую кислоту (-1 л) и концентрированный раствор гидроксида аммония (630 мл). Расход поддерживают на этом уровне до окончания ферментации (143 ч). Выход комплекса А-21978С составляет 1,772 г/л. Концентрация фактора А-21978С,д составляет 0,739 г/л или 42% от общего количества комплекса А-21978С.

Пример7. Увеличенное получение А-21078С,1 .

Первичную, вторичную и третичную стадии получения инокулята проводят так, как описано в примере 1. Стадия

продуцирования инициирована так, как описано в примере 1, за тем исключением, что, начиная с 28 ч, в ферментационную среду вводят стерильный раствор, состоящий из 25% (об./об.)

ундекановой кислоты и 75% метилолеата, при расходе 0,13 мл на 1 л ферментационного бульона в 1 ч до окончания процесса ферментации через 144 ч. Выход комплекса А-21978С составляет 1,62 г/л. Концентрация фактора А-21978С,, (формула I: R - ундека- ноил) составляет 0,70 г/л или 43% от общего количества комплекса A-2I978C. В комплексе А-21978С, полученном по

способу, описанному в примере 1, фактор A-2I978C,, не обнаружен.

Примере. Увеличенное получение А-21978С.

Первичная, вторичная и третичная стадии культивирования инокулята выполнены так же, как описано в примере 1. Стадия продуцирования инициирована так же, как описано в примере 1, за тем исключением, что, начиная с 28 ч, в ферментационную среду вводят стерильный раствор, состоящий из 25% (объем-объем) лауриновой кислоты и 75% метилолеата, при расходе 0,13 мл/л ферментационного бульона в 1 ч до окончания ферментации через 144 ч. Выход комплекса А-21978С составляет 1,,12 г/л. Концентрация фактора А-21978Су (формула I:R - додека ноил) составляет 0,372 г/л или 33% от общего количества комплекса А-21978С.

П р и м е р 9. Вариант получения комплекса А-21978С. Комплекс А-21978С получен по ме- ;тодике, описанной в примере 1, но с ;применением культуры Streptomyces :roseosporusNRRL 11379.

U52484

10

10

П р и м е р 10. Вариант способа увеличенного получения А-21978С,о

. Получают антибиотики A-2I978C,

то по методике, описанной в примере 6,

но с применением куль .-уры Streptomy- ces roseosporus NRRL H379.

Пример II. Получение комплекса А-21978С во встряхиваемой колбе.

Применяют методику, описанную в примере 1, но в условиях встряхива°- мой колбы с применением следующей ферментационной среды, г/л:

Глюкоза7,5

15 Декстрин30

Гидролизован- ный ферментом казеин5

Пептон5

20 Меласса2,5

Деионизированная водаДо 1 л

Выход комплекса A-2J978C на этой ферментационной среде составляет 25 1800 мкг/мл бульона.

В табл.1 представлены инфракрасные спектры поглощения комплекса А-21978с и факторов (в виде натриевых солей, таблетки из бромистого 30 калия).

Таблица 1

Продолжение табл,1

13

Продолжение таОл.З

УФ (HjO), 220 (46,250)у25 ет характеристики, аналогичные 249 ( 8550); 255 ( 10,500); 261 А-21978Сс. (Е 10,250); 264 (f 4950); 288

(4000); 264 (4000).Использование изобретения позволяАминокислотньй анализ приведен в получать как антибиотический комп- табл.4.Таблица 4 - леке, так и производные антибиотических факторов более простым способом.

Формула изобретения

,,.. -СНт НОоС Х-

NО

о н,

II I

./.N

1 II ./

0-/ ,/ ./0

. о

НзС- Ч-н

Н

0

ш

// у I НТ(

ох H--N(I N .

. N

о

X

о

З

14

Продолжение табл.4

35

1„ Способ получения производных- антибиотиков А-21978С формулы

о н,

II I

./.N

1 II ./

о

Н II

Н CONHi

N II NH-R

-./ х-Ч Х

Iи NJI 5;.

fill 1. ..

О

СОгН

Н

J

Н

.X

.н.

15 52484,

где R - Cg-C,2 -алканоильная группа,и каприловой кислоты с последующим

отличающийся тем, что,выделением целевого продукта,

с целью упрощения способа, штамм2. Способ поп.1,отличаюStreptomyces roseosporus NRRL 15998. щ и и с я тем, что используемая Cgили NRRL 11379 культивируют в пита-С,, -алкановая кислота является капротельной среде, содержащей источникиновой кислотой, нонаноьой кислотой,

углерода, азота и минеральные соли ундекановой кислотой, лауриновой кисв условиях аэрации и перемешивания влотой или их эфиром или солью,

присутствии метилолеата и соответст-ю 3- Штамм стрептомицета Streptomyвующей Cg-C,j-алкановой кислоты илиf es roseosporus NRRL 15998, испольэтилового эфира капроновой кислоты,зуемый для получения антибиотических

или соли аммония капроновой кислотывеществ А-21978С.