Способ получения лимонной кислоты Советский патент 1975 года по МПК C12D1/04 

Обнаружено, что при работе по предложенному непрерывному способу образуются меньшие количества изолимонной кислоты по отношению к лимонной кислоте, чем в случае периодического процесса с использованием того же штамма микроорганизма. Пример 1. А. Начальная запусковая операция. Приготавливают жидкую среду, содержаш,ую 5 г/л Bacto Casitone (торговый препарат, представляющий собой панкреатический гидролизат казеина, выпускаемый фирмой Difco Laboratories; Detroit, Michigan, USA) разливают ее по 600 мл в колбы объемом 2,8 л, в каждую колбу добавляют 45 мл (34,5 г) н-парафинов, содержащих от 14 до 16 атомов углерода, полученных от The continental Oil Company, New Jork, USA. После стерилизации среды каждую колбу засевают смывом с косяка со штаммом Candida lipolytica 20228 и выращивают на качалке при 26-27°С в течение 48 час. В ферментационную среду, содержащую 2,6 г/л кукурузного экстракта, 4,0 г/л сульфата аммония, 15 г/л мела и 200 мл/л (153 г/л) н-парафинов (Си-Cjg), добавляют 5% посевного материала. Выращивание осуществляют в 2 л среды в течение 53 час при 26-28°С и продувании воздуха со скоростью 1,25 л/мин. 270 мл этого посевного материала добавляют к 5 л стерилизованной среды следующего состава: мочевина - 2,0 г/л; MgSO4-71 20 - 0,4 г/л; СаСОз - 6,0.г/л; КН2РО4 - 0,75 г/л; тиамин, НС1 - 0,25 мг/л; Fe++ - 0,15 мг/л; Zn++ - 0,5 мг/л; Си++ - 0,125 мг/л; Мп++ - 0,01 мг/л. К этому питательному раствору добавляют 980 мл/л (750 г/л) н-парафинов (Си-Cie). Выращивание осуществляют в ферментере при 26°С, перемещивании мешалкой со скоростью 1400 об/мин и продувании воздухом со скоростью 3,0 л/мин. В первые 24 час величину рН поддерживают равной 7,25, добавляя водный раствор аммиака. Затем по мере образования кислоты рН снижают до 3,5 и далее поддерживают на этом уровне, добавляя водный раствор аммиака. Б. Непрерывный способ. После 71 час в ферментер начинают непрерывно подавать среду со скоростью порядка 2л в день (1,4 мл/мин) следующего состава: 0,4 г/л MgSO4-7H2O; 0,75 г/л КН2РО4; 0,25 мг/л тиамина, НС1; 0,6 мл/л HClFe++ - 0,3 мг/л; Zn++ - 1,0 мг/л; Си++ - 0,25 мг/л и Мп++ - 0,02 мг/л. О;иовременно вводят те же самые н-парафины (Си-Cis) со скоростью 353 мл (270 г/сутки или 0,25 мл/мин). Со скоростью 2 мл/сутки добавляют пеногаситель Ucon LB-625. Скорость подачи воздуха увеличивают до 3,5 л/мин, температуру поддерживают равной 26С и рН - равным 3,5 с добавлением водного раствора аммиака. Объем среды увеличивают приблизительно до 7л и, когда достигают этого уровня, среде дают возможность перетекать в приемник. Продукт, который собирают в приемнике, ежедневно анализируют, оттитровывая образцы щелочью, чтобы определить свободную кислоту, а также после добавления формальдегида, чтобы определить кислоту, которая нейтрализована аммиаком. Кроме того, пробы из приемника центрифугируют и прозрачную жидкость анализируют подобным способом для определения содержания кислоты, а также отдельно на содержание лимонной кислоты с использованием пентабромацетона и на соотношение лимонной и изолимонной кислот методом газожидкостной хроматографии. После того, как общее время синтеза составит 304 час (71 час начальная пусковая операция и 233 часа непрерывный способ работы), количество синтезированной лимонной кислоты равняется 4,248 кг (считая на моногидрат) при общем весе введенных н-парафинов 3,337 кг, что дает общий выход 127%. Доля лимонной кислоты составляет 92% от общего количества лимонной и изолимонной кислот. Углеводороды, использованные в примере 1, имеют следующий состав, вес. %: Нормальные алканыС ;14 0,0 С 14 8,4 С 15 64,9 С 16 21,5 С 17 4,5 С 180,7 С 18 0,2 Другие углеводороды0,2 Примеры 2 и 3. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но используют сначала (а) углеводороды, состоящие из нормальных парафинов, содержащих от 14 до 17 атомов углерода, которые получены от British Petroleum Company Limited, of London, England, a затем (6) нормальные парафины с содержанием углеродных атомов от 16 до 19, которые получены от Texaco Inc., Petrochemical Department, of New-Jork, USA. Получены сходные результаты. Эти углеводороды имеют следующие составы, вес. %: аб Н-алканы 0,1 С 13 0,2 С 13 3,9- С 14 20,8 С 14 0,6 С 15 32,7 С 15 2,8 С 16 27,1 С 16 12,4 С 17 13,9 С 17 30,8 С 18 0,9 С 18 34,1 018 0,0 С 19 14,0 -С 20 1,9 -С 21 0,5 Другие углеводороды0,62,7 В каждом из указанных выше примеров величину рН среды во время непрерывного процесса поддерживают равной 3,5, а температуру среды 26°С. Примеры 4-7. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но величину рН среды в течение непрерывного процесса поддерживают равной величинам, указанным в табл. I. Таблица 1 Примеры 8-11. Повторяют процесс, как в примере 1, но температуру среды поддерживают в течение непрерывного процесса такой, как указано в табл. 2. Таблица 2 5 10 15 20 25 30 б Предмет изобретения 1. Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей Candida lipolytica при постоянной аэрации в питательной среде, содержащей углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые питательные вещества, с последующим выделением лимонной кислоты, отличающийся тем, что, с целью обеспечения непрерывности процесса, осуществляют подачу в ферментационную среду углеводородов и независимо подачу необходимых питательных веществ и отвод среды со скоростью, обеспечивающей поддержание углеводородов в объеме среды на постоянном уровне, преимущественно 5-20 вес. %, при этом рН среды поддерживают равным 2,2- 4,0, преимущественно 3,2-3,5. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из вида Candida lipolytica используют штамм АТСС20228. 3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют углеводороды, представляющие смесь н-иарафинов, содержащих от 9 до 19 атомов углерода в молекуле. 4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что рН поддерживают в желаемом интервале, добавляя газообразный аммиак или его водный раствор.