Способ получения вещества рейхштейна и его производных Советский патент 1977 года по МПК C12P1/04 A61K38/22 

Натрий хлористый Вода питьевая рН 7,3-7,4

Культуру I генерации выращивают в течение 24 час нри 28°С на круговой качалке с 120 об/мии. I генерация культуры является посевным материалом для подготовки II генерации Corynebacterium mediolaniim Р/383.

Культуру II генерации выращивают в 25литровом стеклянном ферментере с рабочей емкостью 8 л на среде СМ/6. Ферментер со средой стерилизуют в течение 20 мин при 120°С. Посевной материал стерильно переносят в ферментер в количестве 0,6% от объема питательной среды в ферментере. Культуру II генерации выранцивают в течение 24 час при перемешивании со скоростью 500 об/ /мин, аэрации 0,7 л/л в мин, температупе

зз°с.

Трансформацию моноацетата вещества R в вещество 5 Рейхштейна приводят в 25-литровом стеклянном ферментере с 8 л питательной среды следующего состава, г: Дрожжевой экстракт2,5

Натрий фосфорнокислый

двузамещенный4,5

Калий фосфорнокислый

одиозамещенный1,0

Вода питьеваяДо 1,0

рН 7,0-7,1

В ферментер со средой ВК/4-1 вносят культуру II генерации в количестве 7,5-15% от объема питательной среды. Одновременно с посевом культуры или в течение первых двух часов после посева в ферментер вносят 200 г (25 г/л) специально подготовленного мелкокристаллического моноацетата вещества R (с размерами кристаллов 40|.i) в виде водной суспензии. Трансформацию проводят в течение 24 час при иеремешивании со скоростью 800 об/мин, аэрации 0,2 л/л в мин, температуре 33°С, рН 7,0-8,2 (без доведения). В качестве пеногасителя ирименяют аитифомсилан.

Контроль процесса трансформации осуществляют с использованием метода тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol t/V-254.

Но окончании трансфорд1ации выделяют вещество S Рейхштейиа из культурной жидкости трехкратной экстракцией этилацетатом по 20 л. Этот экстракт упаривают в вакууме при 50°С до 1,5 л.

Из упареппого экстракта после 6-часовой выдержки цри 5°С отделяют фильтрацией выделившееся веидество S Рейхщтейна и сущат в вакууме при 60°С в течение 6 час. Получают 132 г вещества 5 Рейхщтейна. Маточный раствор повторно упаривают в вакууме до 150 мл и аналогично первому кристаллизату выделяют дополнительно 16,5 г вещества 5 Рейхщтейна. Продукт присоединяют к основному веществу. Маточный раствор упаривают досуха, продукт суспендируют в 50 мл этилового эфира и после отделения получают дополнительно 0,75 г вещества 5 Рейхщтейна.

Всего выделяют вещества S Рейхщтейна 149,25 г (74,63% от загруженного моноацетата вещества У) со следуюнлими константами: температура плавления 206-207°С, удельное вращение (а) ( i хлороформ), удельное поглощение в УФ,Е-470

при .макс 241-242 ПМ.

Пример 2. Получение 4-прегнен-16а-метил-17а,21-диокси-3,20-диона (16а-метил веHjecTBa 5 Рейхштейна) из 5-прегиен-16а-метил-21 -ацетат-Зр, 17а,21 -триол-20-она (1 бос-метил моноацетата вещества R).

Культуру Corynebacterium mediolanum Р/383 выращивают на среде PS аналогично нри меру 1.

Для получения культуры I генерации делают смыв с поверхности среды PS 5 мл

физиологического раствора и 0,5 мл полученной суспензии засевают 50 мл питательной среды СМ/6, находящейся в конических колбах емкостью 250 мл. Состав среды СМ/6 приведен в иримере 1.

Культуру I генерации выращивают в течение 24 час при 28°С на круговой качалке с 240 об/мин. Культура I генерации в количестве 0,6% от объема питательной среды является посевным материалом для подготовки

II генерации культуры.

Культуру II генерации выращивают в 250миллилитровых конических колбах с 50 мл питательной среды СхМ/б в течение 24 час при 28°С иа круговой качалке с 240 об/мин.

Трансформацию 16а-метил моноацетата вещества R в 16а-метил вещество 5 Рейхштейна нроводят в 250-миллилитровых конических колбах с 50 мл питательной среды ВК/4-2 следующего состава, г:

Дрожжевой автолизат5,0

Натрий фосфорнокислый

двузамещениый4,5

Калий фосфорнокислый однозаменный1,0

Вода питьевая ГОСТ 2874-73 До 1,0

рН 7,1-7,2

В колбу со средой ВК/4-2 вносят 7,5% (от объема питательной среды) культуры II генерации. Одновременно с посевным материалом вносят 500 мг (10 г/л) специально подготовленного мелкокристаллического стероида (с размерами кристаллов : 40|Li) в виде водной суспензии и проводят трансформацию в течение 16 час при 28°С на круговой качалке с 240 об/мин.

Контроль процесса и определение количественного выхода 16-метил вещества S Рейхщтейна осуществляют с использованием методов тонкослойной хроматографии на пласгипах Silufoi UV-254 и спектрофотометрирования полученных элюатов пятен с пластинок.

Выход конечного продукта составляет 87,7% от загруженного 16а-метил моиоацетата вещества R.

Применение предлагаемого способа позволяет без изменения аппаратурного оформления процесса, на тех же питательных средах готовить более активную культуру, способную без снижения выхода конечного продукта трансформировать пятикратное количество стероида, внесенного в один прием в трансформационную среду, т. е. отпадает необходимость его дробной загрузки, что уменьшает трудоемкость процесса. За счет совмещения двух стадий (подготовки трансформирующей культуры и процесса трансформации), приводящего к сокращению длительности процесса на 14-20 час, увеличения нагрузки исходного стероида до 25 г/л значительно сокращаются энергозатраты, расход сырья на приготовление питательных сред и повыщается экономическая эффективность процесса.

Формула ц 3 о б р е т е и и я

1. Способ получения вещества 5 Рейхштейна и его производных путе.м выращивания

щтамма Corynebacterium mediolanum Р/383, внесения полученной трансформирующей культуры и исходного стероида в питательную среду для трансформации с последующи.м выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, используют трансформирующую к}льтуру в ранней фазе логарифмического роста, а исходный стероид вносят однократно.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что исходный стероид вносят одновременно с трансформирующей культурой.

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что исходный стероид вносят в течение первых двух часов после внесения трансформирующей культуры.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что исходный стероид вносят в количестве не более 25 г/л среды.