Способ получения окситоцина и дезаминоокситоцина Советский патент 1977 года по МПК C07C103/52 

Изобретение относится к улучшенному способу синтеза биологически активных гормонов - окситоцина и дезаминоокситоцина, нашедших широкое применение в медицине.

В литературе широко известен способ получения окситоцина, исходя из S,S - дибензилзащиш,енного нонапептида-амида W-карбобензокси - S - бензил - цистеинил тирозил - изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинил-пролил-лейцилглицина или амида N-бутилоксикарбонил - S - бензил - цистеипил - тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинил - пролил - лейцилглицина отщеплением S - заш,итных групп.

Известный способ получения дезаминоокситоцина также состоит в отш,еплении заш,итных групп от S,S - дибензилзаш,ишенного нонапептида - амида S - бензил - (3 - меркаптопропионил - тирозил - изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензил - цистеинилпролил-лейцил-глицина.

Отщепление S - бензильных и .N-Сво-групп осуществляют металлическим натрием в жидком аммиаке при температуре от -60 до -30°С с последующим окислительным замыканием цикла или кислородом воздуха, или феррицианидом калия. Выход окситоцина при 9ТОМ 18-33%, дезаминоокситоцина - 31-

38%, окситоцическая активность 70-130 и 684 МЕ/мг соответственно.

Недостаток способа состоит в применении для отщепления защитных групп металлического натрия в жидком аммиаке, что снижает выход и качество целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ отщепления S - бензилзащитных грзпп от защищенного нонапептида - N - карбобензокси - S - бензил - цистеинил-тирозилизолейдил - глутаминил - аспарагинил-5-бензил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина электролизом в жидком аммиаке при -60°С в течение 1,5 ч; замыкание дисульфидного

цикла с образованием окситоцина проводят

известным методом, например кислородом

воздуха. Выход окситоцина составляет 28%,

окситоцическая активность - 107 МЕ/мг.

Недостатками известного способа являюся:

низкий выход целевого продукта, связанный с образованием побочных продуктов на стадии отщепления защитных групп в жидком аммиаке, недостаточно высокая окситоцическая активность и сложность проведения процесса,

связанная с осуществлением синтеза в жидком аммиаке при температуре -60°С.

Цель изобретения - повышение выхода и качества целевого продукта и упрощение технологии процесса. Это достигается описываемым способом получения окситоцина и дезаминоокситоцина из S - защищепного нонапептида формулы NВОС - R - тирозил - изолейцил - глутаминиласпарагинил - цистеипил - пролил - лейцилглицина, где R - цистеинил, р-меркаптопропионил, отщеплением S - защитных групп электролизом с последующей окислительной циклизацией и выделением целевого продукта, заключающийся в том, что в качестве S-защитных групп используют S - бензамидометильную группу и отщепление последней проводят электролизом в среде диметилформамида при 20-30°С. Реакции электрохимического отщепления S-защитных групп протекают за 40-50 мин. Последующее окислительное замыкание дисульфидного цикла проводят 0,0114 н. раствором феррицианида калия. После очистки продукта .методом гельфильтрации на Sephadex G-15 получают дезамипоокситоцин с выходом 67%, ВОС-окситоцин - 68-72%. Обработка последнего 90%-ной трифторуксусной кислотой приводит к образованию окситоцина с выходом 52-57%. Окситоцитоцическая активность полученных продуктов: 155- 174 МЕ/мг для окситоцина и 680 МЕ/мг для дезаминоокситоцина. Электрохимическое отщепление S - бензамидометильной группы проходит селективно, не затрагивая пептидные связи, это исключает образование побочных продуктов и обеспечивает увеличение выхода и чистоты целевого продукта. Пример 1. Окситоцин. 100 мг (0,066 ммоль) амида N-BOC-S-бензамидометил - цистеинил - тирозил-изолейцилглутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина растворяют в 8 мл безводного диметилформамида и электризуют на ртутном катоде на фоне 1%-ного BU4NC104 в безводном диметилформамида при напряжении от -2,0 до -2,2 В и температуре 20-23°С в течение 35 мин. Растворитель упаривают при пониженном давлении в атмосфере азота при 20°С, остаток растворяют в 100 мл воды. рН полученного раствора доводят до 70,5 н. раствором аммиака. Продукт окисляют 9,2 мл 0,0114 н. раствором феррицианида калия в течение 30 мин в атмосфере азота. Желтоватый раствор обрабатывают ионнообменной смолой Dowex 2X10 (Cl) в течение 15 мин до исчезновения желтой окраски, фильтруют. Фильтрат упаривают в вакууме при температуре 20-25°С. Полученный маслянистый остаток растворяют в 3-5 мл 50%-ной уксусной кислоты, вносят в колонку (2,5X150) с Sephadex G-15 и элюируют 50%-ной уксусной кислотой. Элюат лиофилизуют. Получают 55 мг (68,8%) ВОС - окситоцина; т. пл. 167-169°С. alg -70° (с 0,1; этиловый спирт). Найдено, %: С 47,92; Н 6,72; N 13,61. C48H74Ni2Oi4S2-6n2O. Вычислено, %: С 47,44; Н 7,13; N 13,82, 50 мг ВОС - окситоцина обрабатывают 6мл 90%-ной трифторуксусной кислоты при 20°С в течение 30 мин, фильтруют, к фильтрату прибавляют 40 мл воды и смесь упаривают в вакууме при 30°С. К остатку добавляют еще 40 мл воды, лиофилизуют. Продукт сущат в вакууме, получают 34,4 мг (83,1%) окситоцина. Выход окситоцина 52%, считая на защищенный нонапептид. (с 0,1; 50%-ная уксусная кислота). Окситоцическая активность 155 МЕ/мг. Пример 2. Окситоцин. 200 мг (0,132 ммоль) амида N-BOC-S-бензамидометил - цистеинил - тирозил-изолейцилглутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина растворяют в 20 мл безводного диметилформамида и электролизуют на ртутном катоде на фоне 1%-ного BU4NC1O4 в безводном диметилформамиде при напряжении от -2,0 до -2,2 В и температуре 25-30°С в течение 45 мин. Обработкой реакционной смеси, аналогично описанной в примере 1, получают 115 мг (71,9%) ВОС-окситоцина; т. пл. 168-170°С. -70,3° (с 0,2; этиловый спирт). Найдено, %: С 47,87; Н 6,84; N 13,60. C48H74Ni2Oi4S2-6H2O. Вычислено, %: С 47,44; Н 7,13; .N 13,82. Отщеплением ВОС-группы 90%-ой трифторуксусной кислотой получают 75,5 мг (79,2%) окситоцина. Выход 57%, считая на защищенный нонапептид. ,3° (с 0,1; 50%-ная уксусная кислота). Окситоцическая активность 174 МЕ/мг. Пример 3. Дезаминоокситоцин. 68 мг (0,052 ммоль) амида S - бензамидометил - р - меркаптопропионил - тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил - лейцилглицина растворяют в 8 мл безводного диметилформамида и электролизуют на ртутном катоде на фоне 1%-ного BU4NC1O4 в диметилформамиде при температуре 20-25°С в течение 40 мин. Растворитель упаривают при пониженном давлении в атмосфере азота при 20°С, остаток растворяют в 100 мл воды. рН раствора доводят до 7 добавлением 0,5 н. аммиака и продукт окисляют 6,4 мл 0,0114 н. раствором феррицианида калия в течение 30 мин в атмосфере азота. Реакционную массу обрабатывают ионообменной смолой Dowex 2X10 (С1) в течение 15 мин до исчезновения желтой окраски, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме при температуре 20-25°С. Остаток растворяют в 3 мл 50%-ной уксусной кислоты, вносят в колонку (2,5X150 см) с Sephadex G-15, элюируют 50%-ной зксусной кислотой. Собранный элюат лиофилизуют, получают 33,3 мг (65%) дезаминоокситоцина.

,5° (с 0,5; 1 и. уксусная кислота).

Окснтоцическая активность 650 МЕ/мг (по тесту сокращения матки).

Пример 4. Дезаминоокситоцин.

131,4 мг (0,1 ммоль) амида S - бензамидометил - р - меркаптопропионил - тирозил-изолейцил - глутаминил - аспарагинил - S - бензамидометил - цистеинил - пролил-лейцил-глицина растворяют в 15 мл безводного диметилформамида и электризуют на ртутном катоде на фоне 1%-ного Bu4NC104 в диметилформамиде при напряжении от -2,0 до -2,2 В и при температуре 25-30°С в течение 45 мин.

Обработав реакционную массу в условиях.

описанных в примере 3, получают мг

(70%) дезаминоокситоцина.

-90° (с 0,5; 1 и. уксусная кислота). Окситоцическая активность 680 МЕ/мг (по тесту сокращения матки).

Формула изобретения Способ получения окситоцина и дезамипоокситоцина из S - защищенного нонапептида

формулы N - БОС - R - тирозил - изолейцилглутаминил - аспарагинил - цистеинил - пролил - лейцил - глицина, где R - цистеинил, р-меркаптопропионил, отщеплением S-защитных групп электролизом с последующей окислительной циклизацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода, повышения качества продукта и упрощения процесса, в качестве S - защитных групп используют S - бензамидометильную группу и проводят электролиз в среде диметилформамида при 20-30°С.