Штамм N 806-продуцент 2 кето- гулоной кислоты Советский патент 1976 года по МПК C12K1/02 C12D13/06 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма - продуцента 2-кета-/-гулоновой кислоты, используемой при биологическом получении аскорбиновой кислоты в медицинской и пищевой промышленности.

Известный штамм Pseudomonas fluorescens С-4 характеризуется едва заметным ростом на средах с сорбозой в качестве единственного источника углеродного питания в отличие от остальных видов, у которых рост отсутствует полностью.

Новый мутантный штамм Pseudomonas fluorescens № 806 получен при ступенчатом воздействии УФ-лучей и двух супермутагенов типа М-метил-иитрозо-Ы-нитрозогуанилииа и К-нитро-Н-метилбиурета.

В результате проведенного воздействия отобран мутант Pseudomonas flurescens ЛЬ 806, который характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, мелкие, размеры 0,4-1,5 мк. Подвижные, встречаются в виде одиночных, чаще в виде коротких цепочек. Перитрихи, грамотрицательные. Спор не образуют.

А1ясопептонный агар. Кремовые колонии, округлые, гладкие с ровными краями. Колонии легко снимаются петлей. Пигмента не образуют.

Картофель и морковь. Рост неинтенсивный, образуют слабый налет бежевого цвета. Физиологические свойства.

Аэроб, максимум роста npii температуре от 28 до 35°С.

Молоко интенсивно нептонизирует иа пятые сутки с образованием сгустка желтого цвета. Желатину разжижает умеренно, окончательного разжижения не наблюдается.

Крахмал слабо гидролизует. Клетчатку не гидролизует.

Сорбоза, глюкоза, галактоза интенсивно усваиваются, причем глюкоза по сравнению с исходным штаммом усваивается слабее.

Левулеза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, декстрин, глицерин, маниит и дульцит не используются. Нитраты восстанавливает на двенадцатые сутки.

Культуры штаммов - исходного Pseudomonas fluorescens С-4 и мутантного Pseudomonas fluorescens Ni 806-хранятся в коллекции института микробиологии и вирусологии АН Казахской ССР.

Штамм Pseudomonas fluorescens № 806 является продуцентом 2-кето-/-гулоновой кислоты и осуществляет непосредственное окисление сорбозы в 2-кето-/-гулоновую кислоту на среде с 10%-ной сорбозой и органическнми компонентами в виде дрожжевого автолизата и гидролизата казеина при рН среды7,6, t 28-ЗО С, обеспечивая выход продукта в количестве от 2,85 до 3,8 г на 100 мл среды. Пример 1 .

а)Получение посевного материала.

10 мл питательной среды, содержащей, .%: сорбозу 1,0, аспарагин 1,0; KHgPOi 0,5, MgS04 0,1, FeSO4 0,1, разливают в качалочные колбы по 100 мл, стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин и засевают Pseudomonas fluorescens № 806, предварительно выращенным на скошенном агаре, из расчета 1 пробирка на 2 колбы. Рост посевного материала ведется при 28°С в течение 24 час на качалке, дающей 180 об/мин.

б)Ферментация.

10 л среды, содержащей, %: сорбозу 10,0, глицерин 0,5, кукурузный экстракт 3,0, MgSO4 0,01; FeS04 0,01; КН2Р04 0,2, NaCl 0,2, воду дистиллированную 1 л (рН среды 7,5),разливают в 100 качалочных колб, стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. В охлажденную среду вносят посевной материал в количестве 10%. Колбы ставят на качалку при 180 об/мин. Ферментация продолжается 48 час. при 28°С, причем через каждые 6 час определяется 2-кето-/-гулоновая кислота методом бумажной хроматографии.

в)Определение содержания 2-кето-/-гулоновой кислоты методом бумажной хроматографии в системе: этилацетат, уксусная кислота, вода -11:2:2. Восходящую хроматограмму обрабатывают О-фенилендиамидом. При изучении ее в УФ-свете обнаруживают желтое светящееся пятно, которое представляет собой 2-кето-/-гулоновую кислоту.

г) Химическое выделение 2-кето-/-гулоновой кислоты по методу Matusaka 1953. Preparation of Vitamin С ву fermentation, J. Fermentation Fech. Japan, 31, 39-42.

С помощью центрифугирования отделяют культуральную жидкость от бактерий. В культуральную жидкость добавляют 3 г сульфида свинца и нагревают до 40°С, после чего оставляют на ночь. Па следующий день над поверхностью раствора пропускают пары сероводорода, очищают, удалив сульфид свинца. Определяют количество Са++ в фильтрате добавлением 5% щавелевой кислоты. Раствор подогревают и пропускают через ионообменную смолу JR-120, полностью удалив излишки Са++. Затем сгущают под пониженным давлением и получают сиропоподобный раствор. Водный раствор продукта в концентрации 1 г на 100 мл дает угол оптического вращения-24,4°. В сиропообразную жидкость добавляют кристаллик чистой 2-кето-/-гулоновой кислоты, ставят в холодильник и через 24 час получают выкристализовавшуюся 2-кето-/-гулоновую кислоту.

Пример 2. Юл ферментационной среды засевают 10%-ным посевным материалом

Pseudomonas fluorescens № 806, как Описано в примере 1. Колбы ставят на качалку и ферментация продолжается в течение 48 час. Образование 2-кето-/-гулоновой кислоты наблюдается уже в первые часы ферментации (через 6 час). Однако наибольшее ее количество наблюдается к 48 час ферментации. К этому времени 2-кето-/-гулоновой кислоты в кристаллическом виде накапливается до 4,6 г.

Пример 3. 10 л ферментационной среды следующего состава, %: сорбоза 10,0, КП2РО4 0,2, К2ПР04 0,7, MgSOi 0,01, (Nn4)2S04 0,1, натрий лимоннокислый 5П2О 0,05, рН-7, засевают 10%-ным посевным материалом

культуры Pseudomonas fluorescens № 806. Колбы ставят на качалку. Ферментация продолжается в течение 48 час. Образование 2кето-/-гулоновой кислоты наблюдается уже через 6 час ферментации. К этому времени 2кето-/-гулоновой кислоты в кристаллическом виде накапливается до 3,2 г.

Допустимые пределы концентраций ингредиентов питательных сред, %

а)Среда для выращивания посевного материала.

Сорбоза1,0-2,0

Аспарагин1,0-1,5

КП2РО40,2-0,5

MgS040,01-0,1

FeSO40,01-0,1

б)Ферментационная среда.

Сорбоза10,0-15,0

Глицерин0,5-1,0

Кукурузный экстракт 3,0-5,0

MgSO40,01-0,1

FeSO40,01-0,1

КП2РО40,2-0,5

NaCl0,2-0,5

Вода дистиллированная, л 1 рП 7,5

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas fluorescens № 806- продуцент 2-кето-/-гулоновой кислоты хранится в коллекции Института микробиологии и вирусологии АН Казахской ССР. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, мелкие, размером 0,4-1,5 мк. Подвижные, встречаются в виде одиночных, чаще в виде коротких цепочек.

Споры не образуют. Рост на средах.

Мясо-пептонный агар. Колонии кремового цвета, округлые, гладкие с ровными краями, легко снимаются петлей. Пигмента не образуют.

Картофель и морковь. Рост неинтенсивный, образуют слабый налет бежевого цвета. Физиологические свойства.

Молоко. Интенсивно пептонизирует на пятые сутки с образованием сгустка желтого цвета. Желатина. Разжижает умеренно, окончательного разжижения не наблюдается. Крахмал. Слабо гидролизует. 5 Клетчатка. Не гидролизует. Сорбоза, глюкоза, галактоза интенсивно усваиваются. Левулеза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сахароза, фруктоза, декстрин, глицерин, маннит5 6 и дульцит не используются. Нитраты. Восстанавливает на двенадцатые сутки. Максимум роста достигается при температуре от 28 до 35°С, аэроб.