Способ получения производных 7-амино-3-цефем-4-карбоновой кислоты Советский патент 1976 года по МПК C12D9/00 

чества - чистоты. При использовании других мгасроорганиэмов не выделяют из реакционной смеси, гак как глубина гидролиза составляет только 4О60%.

Такой способ характеризуется низкой гидролитической активностью используемых ферментных препаратов, вследствие чего длительность гидролиза паже для малых концентрации субстрата очень велика (80ча Применение для получения 7-АДЦК малых концентраций субстрата, обусловленное ниэ кой активностью используемого катализатора, а также малой растворимостью 7-БАДЦК (или 7-ФАД11К) в водных растворах с рН 7-8, приводит к сложному методу выделения целевого продукта с исполь. зованием органических растворителей (необ ходимость регенерации растворителей). Ис.пользование орга1-1ических растворителей для выделения 7-АДЦК несколько увеличивает выход 7-АДЦК вследствие ее меньше растворимости в водно-органической среде по сравнению с водной, однако при этом качество выделяемого продукта невысокое. Цель изобретения - упрощение процесса выделения производных 7-амино-З-цефем-карбоновой кислоты и улучшение их качес ва. Так, при осуществлении предлагаемого способа noJi-чают 7-АДЦК 98-89%-ной чистоты по сравнению с 93%-ной чистотой 7-.АДЦК по известному способу. Кроме того, значительно сокращается как время гид ролиза (30-18О мин по предлагаемому с собу по сравнению с 8О час известного способа), так и общее время процесса - 1 час ЗОмин 3 часа 30 мин по сравнен со 100 час в противопоставляемом методе Это достигается тем, что производные 7-амино-3-.цефем-4™карбоновой кислоты обшей формулы 1 соон где 1 водород, оксиацетил, пиридиний, получают гидролизом производных 7-.бен зил (или феноксиметил)ацетамидо-3-цефеМ -.4-карбоновой кислоты формулы П дсонж где R имеет указанные значения, а й фенил, феноксиметил.

в виде водной суспензии с содержанием г/л обычно при рН 6,5 - 8,5, температуре 2-5О С, который проводят в присутствии деацилирующего фермента из микроорганизма E.CoEi в водорастворимой или нерастворимой форме, а цедевой продукт выделяют из гидролизата при рН-р в кристаллической форме.

Способ осуществляют следующим образом. Навеску соединения II суспендируют в воде, устанавливают рН 6,5-8,5, температуру - 2-50 С. В суспензию вводят навео ку нативного или нерастворимого фермента, В течение гидролиза рН поддержнвают на определенном уровне в указанной области. Предельное содержание субстрата ограничено растворимостью анионной (}зормы соедине1-шй I , которая существенно раствори мости соответствующей tjxjp.Mbs соедкнеккй 1|. Увеличение количества субстрата :(в г/л), взятого для осущес1вления опыта, приводит к увеличению кондектрацик продук тов реакции в гидрсшйзатах, что увеличивает выход на стадии выделения целевого угродук/™ та и уменьшает степе.аь расщепления субстрата вследствие ингибирования процесса гидролиза продуктами реакции. Оптимальный интервал содержания суосгс.рата, обеспечивающий чакболъший суммар-ный выход целевого продзжта, существенно меньше предельной растворимости субстрата и составляет . Для обеспече1-шя П1зактически полного расщепления субстрата в течение ЗО 18Омин необходимо создатъ концентрагсию фермента в реакционной смеси, равную ед/мл. Навеска нерастворимого фермента, взятого для осуществления опыта, должна составлять не более 10% от объема реакционной смеси. В этом случае при примерно 509fa- ном содерь. жании воды в нераствориыс-м ферменте поте ри целевого продукта вследствие его меж фазного распределения между растворогч; и нерастворимым ферментоь составляют около 5% в первом цикле к окаяо 0,5% во втором цикле. Следовательно обычно при1-ле -шег.лую стадию проглывкн нерастворимого фермента после окошшния гкдрализа можто исключить. Эти требования вып-элняютса, если используемые для гидролиза влажные нерастворигл шферментные препараты иыеют удельную ак™ тиБНОсть не менее 8О ед /г. Ис11ояьз}емые для расщепле шя ферментные препараты получают следующим способом, КлеточщЮ биомассу I.Ccs&i , s ко-горой в качестве антисептике добавлен бутилацетат, суспендируют ь воде, обрабатывают раствором полиэлектролита и осаждают активный осадок из фильтра сульфатом аммон Активный осадок фермента или непосредств но используют для гидролиза соединений формулы П , или после перевода его в нера створимую форму. Для получения нерастворимой формы фермент сорбируют на катионитах или анионитах. Сорбции фермента на анионитах предшествует его направленная модификация в растворе. Нерастворимые ферментные препараты, полученные на осно ве анионитов, используют для гидролиза бо лее 100 раз. Для получения нерастворимого фермента могут быть также использова нь приемы ковалентного связывания с носи телями разной природы, а также включение ц структуру полимера. Целевой продукт ™ соединения формулы 1 выделяют из гидролизатов при рН, равном pt J в кристаллической фопмеПример 1, 4 г 7-БАДЦК (12 ммо суспензируют в 200 мл воды. К суспензии добавляют 10 мг ферментного препарата с oSuiHM содержанием ферменга ТОО ед, полученного согласно примеру 5 А. За единицу активности фермента принято его копичество, которое гидролизует О,ОО1 М раствор 7-БАДЦК при рН 7,5 и 40°С с образованием 1 мкмоль 7-АДЦК в 1 мин. Гидролиз 7 БАДЦК проводят при 40°С и автоматическом поддержании рН 7,5 аммиачной водой в течение 60 мин. Полное рас ворение 7-БАДЦК и постоянство рН раство ра свидетельствуют об окончании гидролиза Получают 200 мл раствора, содержащего 2,5 г 7-АДЦК. Раствор охлаждают до 56°С и обрабатывают 1 об. % активного уг ля, Уготп отдел5пот, устанавливают рН раст вора 3,6-3,7 и после перемешивания в течение 4О мин отделяют кристаллический осадок целевого продукта фильтрацией. Осадок промывают, сушат. Получают 2,3 г 7-АДЦК с содержанием основного вещест- ва, равным 99%, Общий выход 88,5%. Пример 2. Юг 7-БАДЦК суспен дируют в 200 мл (ЗО,4 ммоль). Гидролиз проводят в присутствии 1О,5 г нерастворимого фермента с активностью 256 ед/г влажного фермента, полученного в соответствии с примером 56 при рН7,5 и 20 С. Время гидролиза 90 мин. После отделения фермента получают 200 мл раствора с концентрацией 7-АДЦК 0,146 г. Целевой продукт выделяют аналогично примеру 1, Получают 5,96 г 7-АДЦК 98%-ной чистоты. Общий выход 91%, Пример 3. 6,6 г 7-БАДЦК (2О ммоль) суспендируют в 200 мл воды Гидролиз проводят в присутствии 19,2 г неастворимого фермента с активностью 104 ед/г, полученного в соответствии с примером 5 в, „р рн 7,0 и 40°С. Время гидролиза30 мин. Выделение из гидролизата осуществляют путем установления рН, равного 3,5-3,7. Получают 3,85 г кристаллической 7-АДЦК. Выход 90,5%, содержание основного вещества 99%. Нерастворимый фермент снова суспендируют с 6,6 г 7-БАДЦК в 200 мл воды. Гидролиз и выделение целевого продукта проводят аналогично описанном . Операцию повторяют 100 раз. Выход 7-АД11К после проведения 100 операций при использовании одного и того же фермента составляет 94%, :;одержание целевого веад,ества 99%. Пример 4. 5 г 7 ФДАЦК (14,5 ммоль) суспендируют в 200 мл воды в присутствии Юг нерастворимого фермента, полученного по примеру 56, Гидро™ проводят рН 7,5 и 40 С в течение 130 мин. Выделяют 7-АДЦК из гидролиза га анадогично примеру 3. Получают 2,72 г 7-АДЦК 9870-ной чистоты. Пример 5, А, Получение водорасгворимого фермента, 0,5 кг влажной биомассы с содержаш-;е.г сухих вешеств около 2О% и а1 гивностью 1, ед сусяен.дируют з 1 л воды с добавлением 5 об,% бутилацетата. Суспензию выдерживают при рН 7,0 и 40 С в течение 3 час. Затем реакционную массу охлаждают до 3-5 С и обрабатывают раствором пояиэлектролита ВА-2 (200 мл 2%-ного раствора). После перек ешивания в течение 5-10 мин водный экстракт отделяют от сфлоккулированной клеточной массь;, К фильтрату добавляют сульфат аммония до 40% насыщения. После отделения балластных белков концентрацию сульфата аммония доводят до 60% и отделяют активный осадок. Активный осадок, содержащий npntsiepно 60% влаги, высушивают при 4О С в вакууме. Получают 80О ксг ферментного препарата с активностью 0,9310 ед. Удельная активность полученного препарата 7,5 ед/мг белка. Выход фермента 79%. В. Получение высокоочищенного водорастворимого фермента. Активный осадок, содержащий 0,93 -Юед фермента, растворяют в 450 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,О-7,5. К раствору фермента добавляют полиэтиленгликоль с мол. м, 4ООО-60ОО в количестве 2О% от объема, после отделения балластных белков концентрацию полиэтиленгликоля доводят до 35%. Активный осадок растворяют в