Способ получения нерастворимого комплекса пенициллинамидазы путем связывания фермента с ионитом Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 C07G7/02 

раивей, суспендируют в 1 М аСК (переме шивание 2 ч, температура -5 С) для эпюци вепрочво связаввого фермента; и промывают водой. Получают ИПА с активностью до 6ОООед влажного носителя при выходе активности до 6О%. Пример. Модификация (ПА). 2 do г пеофильно Ешсушенного цепарата ПА с обшей активностью 800-lO ед. ПА, удельной активностью вд/мг белка и 45 мг ярко-голубого шстивного дихлортриазинового красителя раствс ют в 15 мл 0,2 М фосфорного буфера, рН-7,5 Раствор выд живают в теченве 2 ч при 28 С, а затем отделают из&1ток несвязавшегс ся красителя на колонке с сефадексом Q -25. Объем колонки 60 мл, навескб сефадекса 17,0 г. Перед заполяеннем колонки сефадексу дают в 0,О1 М фосфатном буфере, рН -7,5. На колонку с сефадексом наносят 14,7 мл раствора, содержащего модифицированную ПА и избыток красителя. МП Л люируют О,О1 М буферо рН-7,5 и получают 25 мл paqjBopa МПА с общим содержанием фермента 78,Р-1О ед ПА, т.е. 98% от активности, взятой на связываше. Содержание ксшалентно связанного красителя определяют спектрофотометт рически, оно составляет в,О1От 1, П р и М е р 2. Иммобилизация ПА. К 1,О анионита Амберлит -938 (сильноосновный анионит на основе стиролдивинилбензола), зернение 0,25-О,5 мм, который, предварительно был приведен в равновесие с О,О1 М фосфатным буфером, рН-7,5, добавляют 3 мл раствора модифицированной ПА, приготовленной в соответствии с примером 1 (МПА), и 17 мл О,О1 М фосфатного фера рН-7,5. Общее содержание фермента, взятого на сорбцию, равно 9,31О ео. ПА. Сорбцию ведут в течение 1 сут при перемешивании при -5 -С Полученную ИПА заливают 2О мл 1 М NaC и десорбируют несвязавшуюся ПА при перемешивании в течение 1 ч(-5 С, операцию проводят дважды). Затем ИПА промывают О,1 М фосфатнь1м буфером (рН-7,5) и водой. Ферментативную активность определяют в условиях, описанных для нативной ПА. Получают 0,91 г ферментного препарата с активностью 62ОО ед/г влажной ИПА (бЕ, ИПА). Эффективность связывания, равная отношению выделяемой активности ИПА к теоретически ожидаемой, которая определяе ся по разности между активностью, взятой на связывание, п активностью в фильтрате, элюятах и промывках, составляет 68%. Общий выход активности ИПА, представляющий отношение выявляемой активности ИПА к активности, взятой на связывание , равек 61%. Для получения ИПА была снята зависимость максимальной скорости реакции от рН в интервале рН 5,5-8,5. Максимум каталитической активности ИПА находится в интервале рН 6,5-6,7, что на единицу рН кислее, чем соответствующий рН для нативного фермента (рН 7,5-7,8). Время полураспада полученной ИПА в максимуме ее каталитической активности (рН-6,5) равна 74О ч, что в :16 раз больше времени полураспада соответствующего нативного фермента в максимуме его активности. Пример 3. Получение 6-аминопенциллансюой кислоты (6-АПК). 5 г ИПА с активностью 6200 ед/г влажной ИПА (влажность 54%) инкубируют в течение 240 мин с 4 г К-соли бензилпеннциллина (10,7 м моля) в 8О мл дистиллированной воды при 2О С и автоматическом поддержании рН 6,5 25%-ным раствором аммиака в реакторе периодического дейс ВИЯ. После отделения фермента получают 8О мл раствора с концентрацией 6-АПК 0,119 ммоль/мл. Раствор охлаждают до 5-6 С и обрабатывают 1% (по объему) активированного угля. Целевой продукт вь1деляют из раствора при установлениирН 3,8-4,1. Кристаллический осадок фильтруют, промывают и сушат. Получают 1,67 г 6-АПК с содержанием 95%. Иммобилизованный фермент снова инкубируют с 4 г К-соли бензилпенициллина в 8О мл дистиллиро-. ванной воды и выделяют целевой продукт, как описано выше. Операцию повтор:ают до 1ОО раз и более. Выход целевого продукта после проведения 1ОО операций составляет 8О,5% от тесфетического, чистота 6-АПК96,5%. В соответствии с методикой, описанной в примере 1, бьша произведена модификация ПА рядом соединений, отличающихся природой реак1П1бнноспособ11Ых и ароматических групп (пара бензола, нафталина, анграхинола), а также количеством ионогенных групп. Последующую сорбцию полученда х .препаратов модифицированной ПА анионитом Амберлитом Dl A-938 и дальнейшую обработку полученной ИПА {фоводят, как описа1Ю выше. Формула изобретения Способ получения нерастворимого комплекса пеНициллинамидазы путем связывания фермента с ионитом, отличающийс я тем, что, с целью повышения эффективности связывания, удельной активности и стабильности комплекса, фермент предва56

ритепьно конденсируют с водораствсфимым1. Патент Вепнкобританин 1302706,

псотиаикпическим ароматическим соединением,Кл, С 3 Н, 1959. а затем сорбируют на анноните.

Источники информации, принятые во ани-2. Патент ФРГ 2143062, Кл. ба 22/04,

мание при экспертвае:81972.

547113