Способ получения азотистых оснований Советский патент 1977 года по МПК C07D471/00 

Таблица 1 Химический состав отходов производства протаминсульфата из молок лососев 1х рыб, высушенных до постоянного веса Азотистые основания описываемым способом получают следующим образом. Пример 1. 500 мг отходов протаминсульфата, высушенных до постоянного веса при 24°С и растертых в порошок, помеш,ают в стеклянную ампулу с последуюш,им добавлением по каплям до полного смачивания 72% НСЮ. Далее из ампулы откачивают воздух. Ампулу затем запаивают и помеш,ают в кипящую водяную баню для гидролиза ДНК отходов до азотистых оснований в течение 1 час. Кислотный гидролиз можно осуществлять одновременно в нескольких ампулах. После осторожного вскрытия ампулы гидролизат, полученный вышеописанным способом, разбавляют в 20 раз элюирующим буфером 0,2 М NH4C1 (рН 10,6), предварительно определив объем гидролизата, например эталонной ампулой. Разбавленный в 20 раз элюирующим буфером гидролизат, содержащий азотистые основания, для отделения механических примесей и осадка центрифугируют в течение 8- 15 мин при 2000 g. Супернатант, содержащий смесь азотистых оснований в 0,2 М аммиачном буфере (рП 10,6), наносят на колонку 15X0.8 см с Дауэкс 1X4 (300 мещ, хлоридная форма). Смолу предварительно промьшают поочередно кислотой и щелочью с целью освобождения ее от загрязнений, в особенности от веществ, поглощающих в ультрафиолетовом свете. Для этого смолу трижды промывают водой для удаления мелких частиц, затем трижды промывают 1 н. раствором аммиака, водой. 1 к. раствором уксусной кислоты и водой до пейтральной рН промывной воды. После последней промывки водой, не содержащей СО2, смола готова к употреблению. Затем смолу переводят в хлоридную форму, путем суспендирования ее в 1 н. ПС1. Заполнение колонки смолой осуществляют в растворе 2 н. соляной кислоты под давлением гидростатического столба жидкости. Заполненную колонку промывают (уравновешивают) тем же раствором, который применяют для элюирования (0,2 М NH4On - 0,2 М Nn4Cl, рП 10,6) до тех пор, пока рН оттекающего раствора не станет равной рП подаваемого раствора. Одни и те же колонки используют многократно после соответствующей регенерации. Элюацию оснований осуществляют указанным выще 0,2 М аммиачным раствором. Скорость элюации 0,5 мл/мин. Фракции собирают на автоматическом коллекторе. Процесс разделения азотистых оснований контролируют при помощи определения оптической плотности каждой фракции на спектрофотометре СФ-4. Идентификацию выходящих пиков азотистых оснований осуществляют по кривым поглощения в ультрафиолете с помощью бумажной хроматографии. Полученные азотистые основания имеют следующие максимумы и минимумы оптического поглощения в ультрафиолете (на спектрофотометре СФ-4): шах, ммк Аденин 262 Гуанин 248 Тимин 265 Цитозин 275 фракции азотистых оснований объединяют, упаривают и идентифицируют. Таким образом, получают четыре фракции азотистых оснований с молекулярным соотношением цитозин- ТИМИН-гуанин-аденин 10,5 : 3,5 : 7 : 45. Сухой остаток, полученный в результате упаривания фракций, растворяют в небольшом количестве воды и наносят на бумагу в виде небольщого пятна. Параллельно испытуемым фракциям оснований наносят четыре свидетеля: аденин, гуанин, цитозин и тимин. Для бумажной хроматографии используют следующие системы растворителей: абсолютный метанол + концентрированная соляная кислота -|- вода (70 : 20 : 5 VJV); изопропиловый спирт + вода-|-концентрированный аммиак (85 : 15 : 1,5 У/К). Положение пятна, испытуемых фракций оснований и свидетелей (Rj) выпадает. В табл. 2 приведен выход целевого продукта из предлагаемого сырья. В конечном итоге из 50 мг высушенных ДО постоянного веса при 24°С отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают цитозина 6 мг, тимина 10 мг, гуанина 6 мг, аденина 15 мг.