Способ получения дезоксирибонуклеозидов Советский патент 1976 года по МПК C07H19/00 

доводят рН гомогената до 7,6 1 н. раствором КОН и добавляют 50 мг ферментного препарата нуклеаз. Общий объем реакционной смеси доводят до 2 л 0,02М раствором MgSO4-7H20 и инкубируют при 37°С в течение 20 час. По окончании ферментативного гидролиза инкубационную смесь центрифугируют в течение 40 мин при 5000 g. Из осадка после центрифугирования экстрагируют в течение 1 час при встряхивании кислоторастворимые комполеиты дезоксирибонуклепновой кислоты 400 мл 7%-ной трихлоруксусной кислоты, приготовлениой Hj основе 0,02М раствора MgSO,i71420, гидролизат и кислотный экстракт объединяют раствором NH40H, рН полученной смеси доводят до 7,0 и вносят 150 мг ферментного препарата кишечной фосфатазы. Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37°С в течение 24 час. Пз упаренного до объема 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центрифугированием за 20 мий ири 4500 g, экстрагируют дезоксирибонуклеозиды 96%ным этаноло.м (из расчета на один объем раствора - четыре объема 96%-ного гидролизного спирта). Спиртовой экстракт дезоксирибонуклеозидов упаривают при 25°С до сиропообразного состояния, затем растворяют в воде, доводят общий объем до 200 мл и смешивают с 85 г активированного угля. Дезоксирибонуклеозиды элюируют с активированиого угля на воронке Бюхнера 8 л 50%-ного этанола, содержащего 1% аммиака. Элюат упаривают, доводят рП до 10,5 28%ным раствором ЫП40П и фильтруют полученфильтровальную бумагу ный раствор через (ватман № 1). Таблица 1

Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов осуществляют ионообменной хроматографией на смоле «Дауэкс 2X8. Элюируют дезоксирибонуклеозиды 2 л 0,4 М раствора формиата аммония (рП 9,6), смешанного с 12л воды (рП ). В фракциях элюата количество дезоксирибонуклеозидов определяют по УФ-поглощению при 260 нм и при помощи цистеинсерной кислоты. Фракции, содержащие дезоксирибонуклеозиды, упаривают до небольщого объема; дезоксирибонуклеозиды выкристаллизовывают при 0°С. Выход дезоксирибонуклеозидов из отходов производства протамипсульфата из молок рыб Приведен в табл. 1. П р и Л1 е р 2. Получение дезоксирнбонуклеозидов кислотной экстракцией. 100 г отходов производства протамицсульфата ьз : :олок рыб тщателыю измельчают, измельченную массу помещают в 850 мл 7%-ной трихлоруксусной кислотЕя, приготовлен1юй па основе 0,02М раствора MgS04-7ni.O, тоигг-:ль1 0 перемещивают в течение 1 час и центрифугируют 40 мин при 5000 g. Осадок отбрасывают, а рН супернатанта доводят до 7,0 раствором Nn.iOH и вносят 150 мг ферментного препарата кищечной фосфатазы. Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37°С в течение 24 час. Из упаренного до 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 4500 g-, дезоксирибонуклеозиды экстрагируют 96%пым этанолом (из расчета на один объем полученного раствора - четыре объема 96%-ного гидролизного спирта). Спиртовой экстракт дезоксирибонуклеозидов упаривают -при 25°€ до сиропообразного состояния, затем растворяют в воде, доводят сбщий объем раствора до 200 мл и смешивают с 85 г активированного угля. Дезоксирибонуклеозлды элюируют с активированного угля на воронке Бюхнера 8 л 50%ного этанола, содержащего 1% аммиака. Элюат упаривают, рЫ остатка доводят до 10,5 2в%-ным раствором ЫП40П и фильтруют раствор через фильтровальную бумагу (ват ман N° 1). Разделение с.меси дезоксирибонуклеозидов осуществляют методом ионообменной хроматографии на смоле «Дауэкс 2X8. Элюируют дезоксирибонуклеозиды 12 л 0,4 М формиата аммония (рП 8,6), смешанного с 12 л воды (рП 9, НП4ОН). В собранных фракциях элюата количесгво дезоксирибонуклеозидов определяют спектрофотометрически и нри помощи цнстеинсерной кислоты. Фракции, содержащие дезсксирнбонуклеозиды, унаривают до небольщого объема, дезоксирибопуклеозиды Выкристаллизовывают нри 0°С. Выход дезоксирибонуклеозидов из отходов производства протаминсульфата из молок Таблица 2

рыб, полученных путем иепосредственпой кислотной экстракции, приведен в табл. 2.

Пример 3. 500 г отходов производства протаминсульфата из молок рыб тщательно измельчают, -помещают в 8,6 л 0,02М раствора MgSO4-71-120, доводят рН до 7,6 1н. раствором КОН, После чего к полученной смеси добавляют 250 мг ферментного препарата нуклеаз и доводят общий объем раствора до 9 л 0,02М раствором MgSO4-7H2O. Реакционную смесь инкубируют при в течение 20 час.

По окончании ферментативного гидролиза инкубационную смесь центрифугируют 40 мин при 5000 g, из осадка дополнительно экстрагируют в течение 1 час при встряхива1 ИИ кислотораствори.мые компоненты ДПК 2 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты, Приготовленной на основе 0,002М раствора М§804-7П2О, гидролизат и кислотный экстракт объединяют, доводят рН до 7,0 раствором КН4ОП и вносят 750 мг ферментного препарата кишечной фосфатазы. Полученную реакционную с:десь гидролизуют при 37С в течение 24 час.

Из упаренного до объе.ма 250 мл раствора дезоксирибонуклеотиды экстрагируют 96%ным этанолом.

Таблица 3

Спиртовой экстракт упаривают при до сиропообразного состояния, растворяют в воде, доводят общий объем до 600 мл и смешивают с 250 г активированного угля.

Дезоксирибонуклеозиды элюируют с активированного угля на воронке Бю.хнера 30 л 50%-ного этанола, содержащего 1% аммиака.

Элюат упаривают, рН остатка доводят до 10,5 28%-кым раствором NH4OH и фильтруют через фильтровальную бумагу.

Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов осуществляют методом ионообменной хроматографии на смоле «Дауэкс 2X8. Дезоксирибонуклеозиды элюируют 35 л 0,4М формиата аммония (рН 8,6), смещанного с 35 л воды (рП 9, NILOH). В собранных фракциях элюата определяют количество дезоксирибонуклеозидов при помощи цистеинсерной кислоты и спектрофотометрически. Фракции, содержащие Дезоксирибонуклеозиды, упаривают до небольшого объема; Дезоксирибонуклеозиды вы«ристаллизозывают при .

Выход дезоксирибонуклеозидов приведен в табл. 3.

Формула и 3 о б р е т е н и я

1.Способ получения дезоксирибонуклеозидов путем гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) пр;: температуре 36-38°С ферментным препаратом, выделенным из лочек лососевых рыб, с использованием разделения образующейся смеси дезоксирибопуклеозидов методом ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения

процесса и удешевления себестоимости получения целевого продукта, в качестве исходного сырья, содержащего дериваты ДНК, используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, которые гидролизуют очищенным от дезаминаз ферментным препаратом пуклеаз, после чего образующиеся дезо ксирибонуклеозиды и дезоксирибонуклеотиды из раствора извлекают кислотной экстракцией с носледующи: 1 повторным гидролизом кишечной фосфатазой.

2.Способ по н. 1, отличающийся тем, что для кислотной экстракции используют 7%-ную трихлоруксусную кислоту.

Источники инфор.мации, принятые во внимание при экспертизе изобретения:

1. Abdul Mauann and H.J.A. Tavr. Journal of Fisheries research board of Canada, 1961 18, № 3, 349-366.