Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов Советский патент 1980 года по МПК C07H21/00 A61K31/787 

Изобретение относится к усовершенствованному способу Получения высокомолекулярных полинуклеотидов, широко применяемых в генетике и ме-, дицине.

Известен способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов, заключающийся в реакции полимеризации нуклеозид-5 -дифосфатов полинуклеотидфосфорилазой при температуре 3037 С и рН 8,0-8,1,отделении белка добавлением фенола, осаждении смеси полинуклеотидов спиртом и в последующем разделении полученной смеси гель-фильтрацией на сефадексе G-lOO на целевой продукт и низкомолекулярную фракцию. Выход полинуклеотидов 55%. Состав полинуклеотидной фракции 80% высокомолекулярных полинуклеотидов, 20% низкомолекулярных полинуклёотидов 1 .

Известный способ имеет следующие недостатки:

сравнительно низкий выход высокомолекулярной полинуклеотидной фракции, что составляет 80% из всех полученных полинуклеотидов;

высокий расход дорогостоящего и дефицитного сырья, так как непрораагировавшие рибонукледёид-5 -дифосфаты и низкомолекулярные 1 полинуклеотилы (20% от полученных полинуклеотидов) далее не используются.

Целью изобретения является увеличение выхода высокомолекулярных полинуклеотидов и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем

10 .что полученную после осаждения спиртом смесь полинуклеотидов предварительно освобождают ют низкомолекулярных приМесей- ультрафильтрацией и последующее разделение гель-фильтра15цией осуществляют на геле ЕД-10, что. позволяет улучшить разделение полинуклеотидной смеси, увеличить выход высокомолекулярных соединений на 15% и повторно использовать выделенные

20 нуклеозид-5 -дифосфат и низкомолекулярные полинуклеотиды.

Предлагаемый способ получения высокомолекулярньах полинуклеотидов заключается в реакции полимеризации

25 нуклеозид-5 -дифосфатов полинуклеотидфосфорилазой при температуре 3037 С и рН 8,0-8,1, в отделении белка органическим .реагентом, предпочти тельно смесью;хлорофо1 «а и изоамило30

Boro спирта в соотношении 2,5:1, в О(:аждении смеси полинуклеотидов спиртом, в предварительном освобождейии полученной после осаждения спиртом смеси от ниэкомолекулярных примесей ультрафильтрацией и в последующем разделении гельфильтрацией на геле БД-10.

Выход полинуклеотидной фракции 55%.

Состав полинуклеотидной Фракции: 95% высокомолекулярных полинуклеотидо, 5% низкомолекулярных полинуклеб идов.

Непрореагировавшйе нуклеозид-5 -дифосфат и низкомолекулярные поли--. нуклеотцды возвращаются в процессе биосинтеза.

Пример 1. 100мг натриевой соли аденозии-з-дифосф.ата растворяют в 1,0 мм 1 М трис-НСб буфера, рН 8,0, прибавляют 1,0 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 3-5 мл фер мента а зсшисимрсти от активности, из расчета 5-6 ед., активности на 100 мкм М субстрата) . Доба;вляют дистиллированной воды до 10 мл и смесь Ийкубируют в термостате при 37°С. 4ejpe3 каждый чаЬ отбирают пробу по 0,2 мл для определения неорганического фосфора, выделенного в реакции. Реакцию останавливают выдерживанием смеси при 3-5 мин, когда наступает значительное снижение скорости ВЁзделенИя ортофосфата. Выпавший осадок отцеитрифугируют 10 мин при 2500 об/мин и и отбрасывают. К центрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 мл изоамилового спирта и 15 МП встряхивают. Полученную смес центрифугируют 30 мин при 6000 об/ми и Поли аде ниловую кислоту (поли-А) высаживают из водного слоя двухкратным объемом этилового спирта с кристалликами хлористого натрия. Полученный осадок растворяют в дистилированной воде. Для освЬбождениЯ раствора от низкомолекулярных примесей paqTBbp пропускают через ультрафильтрат (размеры пор 5000-10000 А).

Получают две фракции: низкомолёкулярную и высокомолекулярную.

Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД-10 (размеры колонки бОх-2) . Получают псши-А с мол.весом 70000-100000. Выход 40 мг.

Низксянолекулярные нуклеотиды (5%) используют вновь для синтеза полинуклеотидов. Низкомолёкулярную фipaкцйю П рдЩСК айт чере ё колонк у с ге лем ЕД-1 (размеры колонки ). Поjiy aiOT непрореагировавший аденозий-5-дифосфат--20 мг;. Колонки промывают и элюируют с О,1 М раствором хлористого натрия. Препарат выпаривают и сушат на ротационном выпарителе. .

744004

Аденозин-5 -дифосфат используют вновь для синтеза полинуклеотидов.

Выход 55%. (Состав пол.ину1 леотидной фракции: 95% высокомолекулярных и 5% низкомолекулярных нуклеотидов). Пример 2. 125 мл натриевой соли уридина-5 -дифосфата растворяют. в 1,0 мл 1 М трис-нсг буфера(рН 8,0), прибавляют 1,0 мл 0,05 М раствора ацетата магния и 3,5 мл раствора ферменQ та (в зависимости от активности из расчета 15-20 ед. активности на 100 мкм М субстрата). Добавляют дистиллированную воду до 10 мл и смесь Инкубируют в термостате при . Через каждый час отбирают пробу по

5 0,2 мл 40%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для определения неорганического фосфата, выделенного в реакции. Реакцию останавливают выдерживанием смеси при 3-5 мин, когда

0 наступает значительное снижение скорости выделения ортофосфата.

В реакции выпавший осадок отцентрйфугируют 10 мин при 2500 об/мин и и отбрасывают. К центрифугату добавляют 2,5 мл хлороформа и 1,0 мл из амилового спирта и встряхивают 30 Мин при б000 об/мин и 4°С. Полиадениловую кислоту высаживают из водного слоя двухкратными объемами этиQ лового спиртаи кристалликами хлористого натрия..

Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Получают поли-А с мол.весом ЮОООО.

c Для освобождения раствора от низкомолекулярных примесей раствор пропускают через улйтрафильтрат (разме-, ры пор, 5000-10000 ). Получают две фракции: низкомолекулярную и высокомолекулярную.

0 Высокомолекулярную фракцию пропускают через колонку с гелем ЕД-10 (размеры колонки ). Получают поли- А с мол.весом 70000-100000. Выход

. 25 Mi-.

5 Низкомолекулярные полинуклеотиды (5%) используют вновь для синтеза полинуклеотидов. Низкомолекулярную фракцию пропускают через колонку с геЛем ЕД-1 (размеры колонки ),

Q Получают непрореагирующий уридин-5 -дифосфат, 40 мг. Колонки промывают и элюируют 0,1 М раствором хлористого натрия. Раствор выпаривают и сушат на ротационном выпарителе. Аденозин-5 -дифосфат используют

вновь для синтеза полинуклеотидов.

Выход 55% (состав полинуклеотидной фракции: 95% высокомолекулярных и 5% низкомолекулярных нуклеотидов).

Формула изобретения

1. Способ получения высокомолекулярных полинуклеотидов путем реакции 5 полимеризации нуклеозид-5-дифосфаfroB полинуклеотвдфосфорилазой при ° 8,0-8,1, отделения белка добавлением органи««« vnL линуклеотидов спиртом и последующего разделения полученной смеси геЛь-5 фильтрацией, отличающийся вогоп пГГ увеличения выхода целевого продукта и упрощения процесca, полученную после осаждения спирTOM смесь предварительно освобождают.. о,тТпи примесей ультрафильтрацией и последующее разделеrV fJT ® ® .геле ьд-хи, ,2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю « и и с я тем, что з качестве органического реагента для осаждения бел используют юмесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5-1/ Источники инЛолмапии принятые во вн манК прГэксАертизе i, ;j. stahl und W Heumann «A procedure fS tSpr dScMm of ongchained polynucleotides usingipilynucleotide giosphorylaJe rom Scroccus lysodeictiaes Acta Biol Meol. Ger. 14 (2) 108-113, 1965 (npoтотип) .