Способ получения молокосвертывающего фермента Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение может быть использовано в ферментной и молочной промышленности для получения ферментов, вызывающих свертывание молока.

Известен способ получения молокосвертывеющего фермента путем культивирования микроорганизмов, продуцирующих фермент на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из этой питательной среды 1.

Предлагается в качестве микроорганизмов, продуцирующих мопокосвертывающий фермент, использовать Plivsarum poEvceptioiEurn.

При этом из микроорганизмов PVivsotPum poEvcepholEurnиспользуют щтамм 491.61.

Способ осуществляют следующим образом.

Культивируют микроорганизмы, продуцирующие фермент, в качестве Есоторых используют щтамм 491.61 Phvsarum poEvcepTiaEuTr относящийся к классу миксомицетов.

Этот микроорганизм в фазе роста находится в форме, называемой pEasTnodiUTn и представляющей собой неравномерную маесу протоплазмы, содержащую мпой ество ядер, не раэдепенных на клетки, имеет х елтую окраску и покрывает собой кескспько квадрат-;;-1ых сантиметров. В благоприятш 1х для жизнедеятельностк условиях плазмодий PhvscsrUTn poEvcsPboiBum растет ъ аэробных условиях при 2О-25- С в аодиой Г;.итател;)Ной среде при рН 4,5-4.6. При этом водная питательная среда содержит источники углерода, азота, а также минерального cojiii. Кроме того, питательная среда может содержат витамины, факторы роста и микроэлементы, а также TaKiie источники углероде, как глюкоза, гидролизаты протеинов, экстракты дрожжей и эмбриона кур, причем гидрохшзаты протеинов и экстракты и эмбриона кур могут быть заменены соответственно смесью аминокислот, биотином или гематином,

-Микроорганизмы выращивают на поверхности твердой подложки или в погруженном состоянии, например, во встряхиваемых колбах или бродильном чане.

При выращивании на поверхности в nnTLi3тельную среду дооавпяют агг.р в предварительно стерилизованную водную питательную , содержащую глюкозу, экстракт дрож жей, гидролизат протеина, минеральные соли и гематин, при этом последний добавляют после стерилизации водной среды. В ука занную питательную среду вносят микроорганизмы PhvsoiruTn poEvcephaCum, заливают чашки Петри и выдерживают при 25°С. Культура развивается в течение несколь ких дней, покрывает поверхность чашек Петри и остается в форме плазмодия в течение 7 дней до появления склеротия. Выращивание на поверхности осуществля ют также на фильтровальной бумаге, питаемой жидкой питательной средой, с помошью капилляров. В случае роста микроорганизмов в погруженном состоянии микроорганизмыPhvsaгитп potvceplioiEuTn имеют вид плазмодия, разделенного на мелкие частички (микроплазмодий) и находящегося в питательной водной среде во взвешенном состоянии. В случае выращивания в колбе в послед нюю вводят предварительно стерилизованную питательную среду, затем вносят плазмодий полученный из культуры на поверхности или из культуры в погруженном состоянии. Выращивание проводят при 2 при встряхиваНИИ колбы для насыщения микроорганизма кислородом. После скрытой фазы, которая длится 12 час, если инокуляцию осуществляют в погруженном состоянии, или 2-3 дня, если ино куляцию осуществляют на поверхности с помощью агара, клетки достигают своих мак симальных размеров через 3 дня. В случае использования бродильного чана в погруженных условиях разведения в последний вводят жидкую питательную среду и стерилизуют, при этом глюкозу вводят только после стерилизации других компонен тов чана. Из погруженной среды берут посев и вводят в бродильный чан. который вы держивают при температуре роста микрооргашгзма, напри.-ер при 25°С. Разведение проводят при перемешивании с помощью сме сителя со скоростью, достаточной для нормального обеспечивания питательной среды кислородом. Получаемый протеолитический фермент, свертывающий молоко, выделяют из водного раствора при выращивании на поверхности путем промывки микроорганизма солевым раствором хлористого натрия, содержащим 9,0 г NaC6 на 1 л воды. При рьтрашиватжи в колбе или бродильном Чоне фермент выделяют путем декантации, фильтрации или центрифугирования с по4ледующим сбором остаточного водного расвора, содержащего фермент. Водный растор фермента подвергают медленному замоаживанию, затвердевщую фазу отделяют и обирают остаточную жидкость путем смеивания ее с буферным раствором, рН котоого способствует активности протолитичес ого фермента. Для получения чистого продукта протелитический фермент отделяют от концентрированного раствора путем осаждения, для чего готовят новый водный раствор этих ротеинов и разделяют его хроматографическим методом. Получаемый фермент разрушает фенилаланиново-метиониновую связь пептидной цепи каппа-казеина, оказывая на молоко коагулирующее действие. Пример 1. Культуру выращивают в погруженном состоянии из микроорганизMOBpilvsoiruTn poE cepliatum, полученного в Швейцарском научно-исследовательском институте рака (Лозанна, Швейцария) в 15 л бродильном чане, на питательной среде состава, вес. %: Глюкоза1,0; Экстракт дрожжей0,15; Гидролизат казеина (триптон)1.0; СаСе ,06; 0,2; О, Об; 0,006; 0,О085; 0,0035; Лимонная кислота0,35; Гематин0,ООО5; Вода (водопроводная) Баланс до 1ОО%. В бродильный чан вводят 8 л водного раствора указанной питательной среды (кроме глюкозы и гематина). Раствор стерилизуют, подогревая его до 121°С под давлением в течение 15 мин. Глюкозу растворяют в воде из расчета 5О г на 1 л и стерилизуют. Затем раствор в бродильном чане охлаждают до 25°С и в чан вводят стерильный водный раствор глюкозы, устанавливают рН смеси 4,5 водным раствором едкого натрия, а затем добавляют гематин, предварительно стерилизованный при 12О°С в течение 15 мин в водном щелочном растворе. После этого в питательную среду вносят 2 л посеба, полученного путем выращивания в колбах в погруженном состоянии в течение 2 дней микроплазмодия Phvsarutn poJvcepTioiEuTnПитательщю среду перемешивают мешалкой