СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ Советский патент 1969 года по МПК C07B57/00 C07J1/00 C07J15/00 C12P33/16 

Изобретение относится к области получения

оптически активных антиподов ряда стероидов.

Предлагаемый способ состоит в том, что

стероидное оптическое неактивное соединение

общей формулы:

хо

Y-С

-Q

// О

где С обозначает оптически неактивный углеродный атом, Q-группу СНаСНа- или -СНа-, X - водород, галоид, карбоксильную группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный радикал с 1-4 атомами углерода, который дополнительно может быть замещен галоидом или гидроксильной амино- или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, Y-остальную часть секостероида, включая кольца А и В, а также его функциональные производные по кетогрунпам, подвергают ферментативному превращению, например, с микрооргализмами или выделенными из них ферментами.

Пример 1. Получение 3-метокси-8(14)секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-экстратетраен-14а-ол17-она (13р-метил-14а-ОН-5М1 или 13а-метил17p-OH-SMi) ферментацией грибками. а) Восстановление З-метокси-8 (14)-секо1,3,5(10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-диона (SM) посредством Aspergillus ochraceus (CBS- Даме).

Ферментация идет с помощью грибковых

щтаммов в колбах для встряхивания.

Колбу Эрленмейера емкостью 2 л, наполненную 500 см питательного раствора из следующих веществ, %: 3 глюкозы; 1 жидкости для замочки кукурузы; 0,2 NaiNOs; 0,1 КН2РО4;

0,05 MgSO4; 0,05 KCl; 0,002 FeSOi; 0,2 K2HPO4 стерелизуют нагреваниемВ течение 30 мин до 120°С и после охлаждения раствор засевают суспензией Aspergillus ochraceus (CBS), которая получается промыванием

культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли.

Взбалтывают предварительно культуру в течение 2 дней при 30°С (число колебаний 145 об/мин), перезасевают затем цо 50 сжз культуры в 10 колб для ферментации емкостью по 2 л с 450 сжз такого же питательного раствора, взбалтывают их в течение 16 час при 30 °С, добавляют в каждую колбу в стерильных условиях по 5 смз 2%-ного этанолового раствора

Ход ферментации контролируют с помощью хроматографии в тонком слое. Для этого на пластинки из кизельгеля по Шталю наносят метилизобутилкетоновые экстракты проб из бродильного чана; пластины с рабочей поверхностью свыше 15 см проявляют в системе хлороформа- ацетона 9:1, опрыскивают реактивом из 1 см концентрироваиной H2SO4 и 20 см 95%-ного этанола, сушат в течение 10 мин при 140°С и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете. SM

13р-метил-14а-ОН-5М1 н 17a-OH-SMi 13р-метил-14р-ОН-8М1 и 17p-OH-SMi RF 0,92, окраска: красновато-желтая

RF 0,72, окраска: красновато-желтая

RF 0,63, окраска: темноватожелтая

Соединенные исходные смеси ферментации экстрагируют дважды 2500 сжз метилизобутилкетона и экстракт при температуре ванны 45 °С сгуш,ают в вакууме приблизительно до 5 сжз. Концентрат очищают хроматографией препарата в тонком слое с применением кизельгеля GF254 в качестве абсорбента и бензол-эфира уксусной кислоты 9:1 в качестве рабочей среды.

Видимую в коротковолновом ультрафиолетовом свете (основную) зону с величиной RF около 0,4 отделяют, извлекают с помощью 100 см хлористого метилена при комнатной температуре, элюат сгущают при температуре ванны 25 °С и остаток перекристаллизовывают из 10 ч. диизопропилового эфира.

Получают 13р-метил-14а-ОН-8М1; т. пл. 101/102°-103,5 °С, -f 47,8° (диоксан, с 1); 13:р-метил-14а-ОН-8М1 может получаться при таких же экспериментальных условиях ферментацией с помощью Aspergillus niger (АТСС 9142).

б)Восстановление SM посредством Rhizopus nigricaus (АТСС 9142).

. 13р-метил-14а-ОН-8М1 можно получить при экспериментальных условиях, описанных в примере 1 (а), ферментацией с помощью Rhisopus nigricaus (АТСС 6227b).

в)Восстановление 8М посредством Penicillium notatum (NRRL 2284).

При экспериментальных условиях, описанных в примере 1 (а) из SM ферментацией посредством Penicillium notatum (NRRL 1982) можно получить 13р-метил-14а-ОН-8М1.

Пример 2. Получение 13(3-метил-14а-ОР18Mi ферментацией посредством дрожжей.

а) Восстановление 8М посредством 8ассНагошусез cerevisiac (NRRL-Y-2250).

Ферментация идет с помощью дрожжей в колбах для встряхивания.

стерилизуют и затем засевают суспензией 8аcharomices cerevisiac (NRRL-Y-2250), которая получается промыванием культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли. Взбалтывают предварительную культуру в течение суток при 30 °С (число колебаний 145 об1мин), перезасевают по 50 смз культуры в 4 колбы для ферментации емкостью 2 л, наполненные каждая 450 сжз такого же питательного раствора, взбалтывают их в течение 6 час при 30°С, добавляют в каждую колбу 5 см 2%-ного этанолового раствора 8М и проводят ферментацию в течение 20 час.

Суспензии для ферментации приготовляют, как описано в примере 1 (а).

Получают 13р-метил-14а-ОН-8М1; т. пл. 101/102-104 °С; «2° + 46,2° (диоксан, с 1)

264 21000.

б)Восстановление 8М посредством 8accharomyces cerevisiac (NCyC 1021).

При описанных в примере 2 (а) условиях из SM ферментацией посредством 8accharomyces cerevisiac (NCYC 1021) получают 13р-метил14a-On-8Mi.

в)Восстановление 8М посредством 8accharomyces carisbergensis (СВ8 1505).

При описанных в примере 2 (а) условиях из SM ферментацией посредством Saccharomyces carisbergensis (СВ8 1505) получают 13р-метил14a-On-SMi.

г)Восстановление 8М посредством Saccharomyces pastorianus (Институт ферментной промышленности, Берлин).

При условиях, описанных в примере 2(а), но со временем ферментации 40 час, из 8М ферментацией посредством 8accharomyces pastorianus может быть получен 13р-метил-14аOH-SMi.

Пример 3. Получение 13р-метил-14а-ОН8Mi ферментацией посредством бактерий.

а) Восстановление 8М. посредством Bacillus esterificans (ВВА-Берлин).

Ферментация идет посредством бактерий в колбах для встряхивания. Колбу Эрленмейера емкостью 2 .д с 500 см питательного раствора из следующих веществ, %: 0,5 глюкозы, 0,2 жидкости для замочки кукурузы; 0,1 экстракта дрожжей; 0,1 пептона (Мерк) стерилизуют и затем засевают суспензией Bacillus esterificans, которую получают промыванием культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли. Взбалтывают предварительную культуру в течение суток при 30 °С (число колебаний 145 o6JMUH.), переносят по 50 CMS культуры в 4 колбы для ферментации емкостью 2 л, каждая из которых наполнена 450 сжз такого же питательного раствора, взбалтывают эти колбы 4 час при 30 °С, добавляют в каждую колбу 5 смз 2%-ного этанолового раствора 8М и проводят ферментацию еще 20 час.

Получают 13р-метил-14а-ОН-5М1, т. пл. 101/102-104 °С.

б)Восстановление SM посредством Bacillus laterosporus (АТСС4517).

При описанных в нримере 3(а) эксперимен-, тальпых условиях, но со временем ферментации 44 час, из SM ферментацией носредством Bacillus laterosporus получают 13|3-метил-14аOH-SMi.

в)Восстановление SM посредством Brevibacterium vitarumeu (АТСС 10234).

При описанных в примере 3(а) условиях SM ферментацией посредством Brevibacterium vitarumeu восстанавливается в 13|3-метил-14аOH-SMi.

г)Восстановление SM посредством Propionibacterium arabinosum (АТСС 4965).

Из SM при описанных в примере 3(а) условиях ферментацией посредством Propionibacterium arabinosum получают 13р-метил-14а-ОНSMi.

д)Восстановление SM посредством Protaminobacter atboflavus (АТСС 8458).

При указанных в примере 3(6) условиях из SM ферментацией посредством Protaminobacter alboflavus получают 13р-метил-14а-ОН-5М1.

е)Восстановление SM посредством Mesentericus spec (Институт Роберта Коха, Берлин).

Из SM при. указанных в примере 3(а) условиях ферментацией посредством Mesentericus spec, получают 13р-метил-14а-ОН-8М1.

ж)Восстановление SM посредством Мусорlana dimorpha (АТСС 4279).

При указанных в примере 3(6) условиях из SM ферментацией посредством Mycoplana dirnorpha получают 13р-метил-14а-О Н-5М1.

з)Восстановление SM посредством Bacillus thuringiensis (ВВА-Дармштадт).

Ферментация идет посредством бактерий в бродильном чане.

Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательной среДы из следующих веществ, %: 0,5 глюкозы; 0,2 ЖИДКОСТИ для замочки кукурузы; 0,5 эксТрйкта дрожжей; 0,1 пептона (Мерк), стериу йзуют нагреванием в течение 1,5 час до 120°С и засевают 1 л выдержанной в течение суток взболтанной культуры Bacillus thuringiensis (ВЙА-Дармщтадт).

Посевной материал получают при условиях, описаных для выращивания посевов в колбах по примеру 3(а).

После однодневного размножения при температуре 29°С, -перемещива.нии (220 об/мин и аэрации (1,65 лгз/чдс) 1,8 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильный чан такого же размера с 28 л того же питательного раствора. После выращивания в течение 6 час при перемещивании и аэрации, как указано выще, добавляют силиконовое масло SH + 5% олеомаргарина из свиного сала в качестве предотвращающего вспенивание средства и раствор 15,0 г SM в 800 слз этанола и проводят ферментацию еще в течение 16 час.

Затем суснензию бродильного чана экстрагируют дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт при температуре ванны 45 °С в вакууме до сиропа и растворяют последний в 150 сжз изопропилового эфира. После выдерживания в течение 20 час при 0°С осажденные кристаллы отсасывают, промывают небольшим количеством холодного изопропилового эфира и высущивают при 60 °С в вакууме.

Выход:-13,1 г 13р-метил-14а-ОН-5М1, т. е. 87% теоретического количества, т. пл. 98/99 100 С.

Вещество может быть очищено перекристаллизацией из 4 ч. спирта.

и) Восстановление SM посредством Protaminobacter alboflavus (АТСС 8458).

При описанных в примере 3(з) условиях SM может быть в значительной степени восстановлен посредством Protaminobacter alboflavus

только в том случае, если через 20 час после добавки субстрата подача воздуха полностью прекратится, и затем проводится ферментация еще в течение 20 час. Чтобы изолировать полvчeнный 13р-метил-14а-ОН-8М1. требуется

растворить концентрат сырого экстракта в хлористом метилене и отфильтровать через колонну с кизельгелем, дезактивированную 10% воды, и кристаллизовать элюат, как описано, из диизопоопилового простого эфира.

Пои м е п 4. Пoлvчeниe 3-метокси-8(14) -секо-1,3,5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17р-ол-14она (13р-метил-17р-ОН-5М|) ферментацией посредством дрожжей.

а)Восстановление SM посредством Saccharomyces ellipsoides (щтамм Токауера, 22, Берлин).

При описанных в примере 2 (а) условиях SM восстанавливают посредством Saccharomyces ellipsoides (щтамм Токауера). Полученный хроматографией препарата в тонком слое сырой продукт перекристаллизовывают дважды из 10 ч. днизопропилового простого эфира.

Получают 13р-метил-176-ОП-5М1; т. пл. 110/112-114°С; «20 - Я9.2° (диоксан, с П; В264 - 20,800.

б)Восстановление SM посредством Saccharomyces pastorianus (Институт ферментативной промыщленности, Берлин).

При описанных в примере 2 (а) условиях из SM ферментацией посредством Saccharomvces pastorianus получают 13|3-мeтил-17p-OП-SMi.

в)Восстановление SM посредством Saccharomyces carlsbergensis (CBS 2354).

При описанных в примере 2 (а) условиях из SM ферментапией посредством Saccharomyces carlsberpensis (CBS) получают 13р-метил-17рOH-SM,.

г)Восстановление SM посредством Saccharomyces uvariim (CBS 1508).

Ферментация идет посредством дрожжей в бродильном чане. Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательного раствора из 5% виноградного сахара и 2% жидкости для замочки кукуцузЫ,

стерилизуют нагреваиием в течение 30 мин до 120°С и засевают 1 л выдержанной в течение суток взболтанной культурой Saccharomyces uvarum (CBS 1508). Посевной материал иолучают при условиях, описанных для выращивания посевов в колбах по примеру 2(а).

После однодневного размножения нри температуре 29 °С, перемешивании (220 об/жан) и аэрации (1,65 мз/час) 1,8 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильный чан такого же размера с 28 л того же питательного раствора. После выращивания в течение 6 час при иеремещивании и аэрации, как описано выше, добавляют силиконовое масло SH -}- 5% олеомаргарина из свиного сала в качестве средства, предотвращающего вспенивание, и раствор 45,0 г SM в 800 см этанола и проводят ферментацию еще в течение 19 час.

Затем экстрагируют суспензию для ферментации дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт нри температуре ванны 45 °С в вакууме до сиропа, разбавляют последний 400 см диизопропилового эфира и оставляют полученный раствор на 16 час при 0°С.

Образовавщиеся кристаллы отсасывают, промывают 25 сжз ледяного диизопроиилового эфира и сушат в вакууме при 60 °С.

Выход: 31,8 г 13р-метил-17р-ОН-ЗМ1, т. е. 71% теоретического количества; т. пл. 106/108-109°С; «2° 34,5° (диоксан, с 1);

6264 20,100.

Соединение может быть очищено нерекристаллизацией из 4 ч.этанола.

Пример 5. Получение 13р-метил-17р-ОНSMj восстановлением SM посредством Сигуиlaria lunata (NRRL 2434).

Ферментация идет посредством грибков в бродильном чане. Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательного раствора из следующих веществ, %: 3 глюкозы; 1 жидкости для замочки кукурузы; 0,2 NaNO.; 0,2 K HPOi; 0,1 КН,РО.; 0,005 MgSOj; 0,05 KCl; 0,002 FeSOi, стерилизуют нагреванием в течение 30 мин до 120°С и засевают 1 л выдержанной в течение 2 дней взболтанной культуры Curvularia lunata (NRRL 2434). Посевной материал получают при условиях, описан-ных в примере 1 (а) для выращивания посевов в колбах.

После двухдневного размножения при температуре 29 °С, перемешивании (220 об1мин} и аэрации (1,65 3 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильный чан такого же размера с 27 л того же питательного раствора.

После выращивания В течение 16 час при перемешивании и аэрации, как описано выше, добавляют Pluronic L 81 в качестве средства, предотвращающего вспенивание, и раствор 6.0 г SM в 450 см этанола и проводят сЬепментацию еще в течение 20 час. Затем экстрагируют суспензию ферментации дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстпакт ппи температуре ванны в вакууме до сиропа.

отделяют последний хроматографией в колонне на 200 г дезактивированного 10% воды кизельгеля в качестве абсорбента и смесях четыреххлористого углерода - хлористого метиле5 па в качестве растворителя для элюирования. Содержащие 13р-метил-17р-ОН-5М1 фракции соединяют и после сгущения перекристаллизовывают из изопропилового эфира.

Пример 6. Получение 3-метокси-8( 14)-се0 ко-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраена-17а-ол14-она (13р-метил-17а-ОН-5М1) восстановлением SM посредством Arthrobacter simplex (АТСС 6946).

При описанных в примере 3(и) условиях SM 5 подвергается ферментации посредством Arthrobacter simplex.

Получают кристаллизат с т. пл. 91/92-95 °С. «2° -16° (диоксан, с 1). Последний многократной фракционированной кристаллизацией 0 очищают из диизопропилового эфира и из этанола.

Получают 13р-метил-17а.-ОП-5М; т. пл. 100/101 -102°С; - 44,3° (диоксан, с 1);

82С4 20,600.

Пример 7. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10)-8,14-эстрапентаен-17р-ола Ci9H22O2 (282, 37).

30,04 г (0,100 моль) 13р-метил-17р-ОН-5М1 кипятят с флегмой 2,5 час в 42 мл метанола и 83 мл хлористого метилена с 0,81 мл концентрированной соляной кислоты. Затем раствор выливают в 85 мл воды, отделяют органическую фазу и водную фазу дважды экстрагируют хлористым метиленом. Соединенные органические фазы промывают до нейтрального состояния раствором бикарбоната и водой и сущат. После отгонки растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают 21,00 г (74,4%) З-метокси-1, 3, 5(10), 8, 14 эстрапентаен-17|3-ола, т. пл. 107-109°С; ос - 141° (с 1, СПСП.

Вещество идентично З-метокси-1, 3, 5(10), 8, 14-эстрапентаен-17р-олу, который получают отщеплением рацемата из рацемического материала, по точке плавления, вращению, всем спектрам, а также по газовой хроматографии и хроматографии в тонком слое.

Пример 8. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ола, С19П2402 (284, 38).

58,00 г (0,205 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапеитаен-17|3-ола гидрируют при помощи 8,2 г предварительно гидрированного 5%,-ного палладия/карбонат кальция в 200 мл тетрагидрофурана. Поглощается в течение 50 мин 4820 мл водорода (95% теоретического количества). Раствор отфильтровывают от катализатора.

После выпч-ривания растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают 39,80 г (68,2%) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ола; т. пл. 123-126°С; ag -71

Пример 9. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10)-эстратриен-17р-ола (эстрадиолметиловый эфир).С19Н2б02 (286,39).

11,35 3 (0,040 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10) - 8-эстратетраен-17|3-ола растворяют в 120 мл абсолютного тетрагидрофурана и при -50 °С, добавляют к раствору 100 мг лития в 120 мл жидкого аммиака и 9,9 мл анилина. При такой же температуре порциями добавляют 340 мг лития и перемешивают еще в течение 10 мин. Затем добавляют 0,72 мл воды в 2 мл тетрагидрофурана, причем раствор становится прозрачным.

После добавления остальных 0.59 г лития раствор перемешивают еш,е 20 мин и обесцвечивают хлористым аммонием. После выпаривания аммиака до-бавляют воду, органические растворители отгоняют в вакууме и остаюш,уюся смесь экстрагируют хлористым метиленом. Соединенные растворы хлористого метилена освобождают с помощью 1 н. соляной кислоты от анилина и промывают раствором бикарбоната и водсЛ до нейтрального состояния.

После сущки раствора, отгонки растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают 8,5 г (74,0%) З-метокси-1, 3, 5 (10) -эстратриен-17р-ола (эстрадиолметиловый эфир); т. пл. 114-116°С; а + 72°. Вещество идентично полученному из натурального материала эстрадиолметиловому эфиру по точке плавления, вращению и всем спектрам, а также по газовой хроматографии и по хроматограмме в тонком слое.

Пример 10. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола-ацетата С21Н240з (324, 40).

5,00 г (0,0167 моль) 133.-метил-17|3-ОП-5М1 обрабатывают в течение 15 час в пиридине при комнатной температуре 30 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в соляную кислоту, экстрагируют раствором хлористого метилена, промывают до нейтрального состояния 1 н. соляной кислотой, раствором бикарбоната и водой. Масло, остающееся после сущки и отгонки растворителя в вакууме, поглощается в 800 мл бензола и кипятится в течение 15 мин в водоотделителе с 2,8 г /г-толуолсульфокислоты. После охлаждения раствор промывают до нейтрального состояния раствором бикарбоната и водой.

Сущка и отгонка растворителя дает 4,89 г (90,5%) З-метокси-1, 3, 5(10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ол-ацетата; т. пл. 79-82°С; « - 180

На газовой хроматограммевещество98%-ное и может применяться для гидрирования в 3метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ол-ацетат.

Для сравнения с ацетатом З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола из отщепления рацемата в рацемическом материале оно перекристаллизовывается из этанола. Получают 3,60 е (66,6%) З-метокси-1, 3, 5.(10), 8, 14эстрапентаен-17р-ол-ацетата; т. пл. 86-87°С; ,. 188 о

Эти данные, а также спектры и хроматограммы идентичны данным ацетата, полученного из отщепления рацемата.

Пример И. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ол-ацетата С21Н2бОз (326,41).

2,40 г (0,0074 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17|3-ол-ацетатата сырого гидрируют с помощью 664 мг предварительно гидрированного 5%-ного палладия на карбонате кальция в 8 мл бензола и 8 м.л тетрагидрофурана. За 2 час поглощаются 180 мл водорода (97% теоретического количества).

После отфильтрования катализатора, отгонки растворителя в вакууме и перекристаллиза-ции из этанола получают 1,61 г (66,6%) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ол-ацетата; т. пл. ПО-113°С; «§ -49°. (с I,

СПС1з).

П р и .м е р 12. Получение З-метп.кси-1, 3, 5(10), 8-эстратетраен-17р-ола Ci9H24O. (284,38).

2,70 г (0,0083 моль 3-метокси-1,3,5(10), 8эстратетраен-17р-ол-ацетата перемешивают при комнатной температуре в течение 3 час в 50 мл 1«. метанолового калийного щелока. При этом вещество полностью растворяется. При охлаждении раствора осаждается продукт. Осаждение дополняется 100 мл ледяной воды.

Получают 2,14г (95,1%) З-метокси-1,3,5(10), 8-эстратетраен-17р-ола, т. пл. 125--127°С; -7,9° (.с 1,СПС1з).

Вещество идентично веществу, полученному гидрированием З-метокси-1, 3, 5 , 8, 14-эстрапентаен-17р-ола.

Пример 13. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола (282,37).

150 мг (0,00046 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ол-ацетата перемешивают в течение 3 час в потоке азота в 3 жл метанолового 1 н. калийного щелока. При этом вещество растворяется постепенно. При охлаждении льдом оно подкисляется 0,6 мл концентрированной кислоты и осаждается 2,4 мл воды.

После перекристаллизаиии из этанола/ воды получают 107,5 мг (82,5%) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8,14-эстрапентаен-17р-ола; т. пл. 101- 102°С; а - 135°С (с 1, СНС1з).

Пример 14. Получение 3-мето-кси-13а-1, 3,5(10) .8Л4-эстрапентаен-17р-ол-ацетата. С21П2,Оз (324,40).

2,00 г (0,067 моль) 13б-метил-14а-ОН-5М1 (равноценно 13а-метил-17р-ОН-5М1) обрабатывают в течение 16 час при комнатной температуре 20 мл пиридина с 12 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в воду, экстрагируют хлористым метиленом и соединенные фазы хлористого метилена промывают до нейтрального состояния соляной кислотой, бикарбонатом и водой,

11

После сушки и отгонки растворителя в вакууме маслянистый иекристаллизующийся остаток поглощается в 50 мл бензола и кипятится в течение 10 мин на водоотделителе с 120 мг /г-толуолсульфокислоты. После разбавления иростым эфиром раствор промывают до нейтрального состояния водой и бикарбонатом, сушат и растворитель отгоняют в вакууме.

Перекристаллизация из этанола дает 1,83 г (84,7%) 3-метокси-13а-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен- 7р-ол-ацетата; т. ил. 127-129°С; .7.20 + 183° (с 1,СНС1з).

Пример 15. Получение 3-метокси-13а-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17|3-ола Ci9H22O2 (282, 37).

800 мг (0,00246 моль) 3-метокси-13а; 1, 3, 5 (10), 8, 14-эстраиентаен-17|3-ол-ацетата перемешивают в течение 3 час в потоке азота с 16 мл 1 н. метанолового калийного ш,елока. При этом веш,ество растворяется. При охлаждении льдом с помош,ью воды проводят осаждение и основательную промывку.

Получают 681 мг (97,6%) 3-метокси-13а-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола.

Разложение при температуре выше 32 °С

,20

+ 199° (с 1,СНС1з).

Вещество по всем спектрам и хроматограммам унифицированное, но очень легко разлагается.

Пример 16. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ол-ацетата С21Н24Оз (324,40).

300 мл (0,001 моль) 133-метил-17а-ОН-ЗМ1 обрабатывают в течение 16 час при комнатной температуре 3 мл пиридина и 2 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в воду, экстрагируют хлористым метиленом и соединенные растворы хлористого метилена промывают до нейтрального состояния соляной кислотой, бикарбонатом и водой. После сущки и отгонки растворителя остается масло, которое поглощается в 8 мл бензола и кипятится в течение 10 мин с 18 мг я-толуолсульфокислоты. После разбавления простым эфиром раствор промывают до нейтрального состояния водой и бикарбонатом, сущат и растворитель отгоняют.

Перекристаллизация из этанола дает 244 мг (70,5%) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ол-ацетата; т. пл. 126-127,5 °С;

,20

+ 197 (с 2, СНС1з).

Пример 17. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17(х-ола С9Н22О2 (282,37).

200 мг (0,000618 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстраиентаен-17а-ол-аиетата перемешивают в течение 3 час в потоке азота с 4 жл 1 н. метанолового калийного щелока. При этом вещество полностью раство.ряется. При охлаждении льдом происходит осаждение водой, осадок отсасывается и основательно промывается.

Получают 128 мг (73,5%) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ола.

12

Разложение при температуре выще «20 197° (,СНС1з).

Вещество должно храниться в холоде, так как оно быстро разлагается.

Пример 18. Получение 3-метокси 8(14)секо-9, 14а-оксидо-1, 3, 5(10)-эстратриен-17она С19Н24Оз (300,38).

400 мг (0,00133 моль) 13а-метил-17р-ОНSMi кипятят в течение 30 мин, с флегмой в 20 мл метанола и 40 мл хлористого метилена с 0,4 мл концентрированной соляной кислоты. После добавления воды отделяется органическая фаза и водная фаза экстрагируется хлористым метиленом. Соединенные органические фазы промывают до нейтрального состояния бикарбонатом и водой, и растворитель отгоняют в вакууме.

Получают 400 мг (100%) З-метокси-8, 14-секо-9|, 14а-оксидо-1, 3, 5 (10)-эстратриен-17она, который является унифицированным по хроматограмме в тонком слое.

Л1ногократная перекристаллизация из этанола дает 45 мг вещества; т. пл. f 9-90°С; а 41,7° (с I, CHCla).

Структура была подтверждена инфракрасной частью спектра, ультрафиолетовой частью спектра, NMR масс-спектром.

Пример 19. Получение 13р-метил-14а-ОНSMi ферментаниией посредством Saccharomyces uvarum (CBS 1508) по методу остаточной клетки.

30 л культуры Saccharomyces uvarum (CBS 1508) из предварительного бродильного чана,

полученной, как описано в примере 4(г), подвергают центрифугированию. Промывают полученные дрожжи дистиллированной водой, центрифугируют еще раз и взвешивают в 30 .л дистиллированной воды. По 500 см суспензии

наливают в 8 колб Эрленмейера емкостью 2л, закрывают их ватной пробкой и взбалтывают (число колебаний 145 об/мин) при 30 °С. Через 4 час добавляют в каждую колбу по 250 мг SM, растворенных в 2,5 см метилцеллозольЬа,

и проводят ферментацию в течение 20 час.

Затем соединяют исходные смеси ферментации, экстрагируют их дважлы с помощью 1 л метилизобутилкетона, сгущьют экстракт в вакууме при температуре ванны 45 °С до сухого состояния и перекристаллизовывают остаток 1 раз из смеси бензола - гексана и 1 раз из этанола.

Получают 13|; -мeтил-14a-OH-SMl; т. пл.

101/102-103°С; «2 + 45,4° (с 1, диоксан).

Пример 20. Получение 13В-метил-14а-ОНSMi ферментацией посредством Saccharomyces

uvarum (CBS 1508) - сухого порощка.

Из 30 л культуры CBS 1508 предварительного бродильного чана получают, как описано в примере 19, центрифугированием доожжи. Последние взвещивают ъ 3 л ацетона, перемешивают суспензию в течение 15 мин, отсасывают дрожжи, взвешивают снова в 3 л ацетона, перемещивают, отсасывают дрожжи и сущат 5

течение 3 час в вакууме при комнатной температуре.

Полученный сухой порошок взвешивают в 30 л дистиллированной воды и применяют эту суспензию для ферментации.

Ферментация SM и переработка исходных смесей происходит, как описано в примере 19.

Получают 13.|3-метил-14а-ОН-5М1; т. пл. 100/102-103°С; ag +43° (с 1, диоксан).

Пример 21. Получение 13(3-метил-14аOH-SMi посредством раствора 20|3-гидроксистероиддегидрогеназы.

К смеси 4,4 мл 0,022 М фосфатного буферного раствора (рН 5,5), 0,7 мл 0,4%-ного DPN в. раствора и 0,03 мл разбавленной в отношении 1 : 5 суспензии 20р-гидроксистероиддегидрогеназы (фирма «Ц. Ф. Берингер унд Зеке, Общество с ограничениой ответственностью Мангейм) добавляют 1 мг SM в 0,05 мл этанола и взбалтывают в течение 15 мин при комнатной температуре В результате анализа хроматографией в тонком слое (см. пример 1,а) обнаруживают в качестве единственного продукта превраш,ения 13р-метил-14а-ОН-8М1.

Пример 22. Получение 13р-этил-3-мето.кси-8 (14)-секо-18-нор-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17р-ол-14-она (13р-этил-17р-ОН-ЗМ1).

При условиях, описанных в примере 4(г), 15,0 г 13р-этил-3-метокси-8 (14)-секо-18-нор-1, 3, 5(10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-диона (13р-этил-5М) подвергают ферментации посредством Saccharomyces uvarum (CBS 1508) в течение 20 час. Затем суспензию ферментации экстрагируют дважды 15 л метилизобутилкетона, сгушают экстракт при температуре ванны 45 °С до сиропа и перекристаллизовывают полученный продукт из изопропилового эфира.

Получают 13р-этил-3-метокси-8 (14) секо-18нор-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17р-ол-14он; т. пл. 85-86,5 °С; а + 15,2° (с 1, диоксан).

Согласно NMR-спектру гидроксильная группа р - постоянная относится к 13р-этиловой группе.

Пример 23. Получение З-метокси-8 (14)секо-D-roHO-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен17ар-ол-14-она (17ap-OH)-(D-roMO-SM).

1,6 г З-метокси-8 (14)-секо-О-гомо-1, 3,5 (10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17а-диона (D-roMo-SM) подвергают ферментации, как описано в примере 20, посредством ацетонового сухого порошка Saccharomyces uvarum (CBS 1508). Полученный сухой продукт очишают, как описано в примере 1,а, хроматографией препарата в тонком слое и перекристаллизовывают из изопропилового эфира.

Получают З-метокси-8 (14)-секо-В-гомо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17ар-ол-14-он; т. пл. 115-116, ag + 28,5° (с - 1, диоксан).

Пример 24. Получение 2-метил-З-метокси8(14)-секо-1,3,5 (10), 9 (11) - эстратетраен14а-ол-17-она.

дят в 16 колб Эрленмейера емкостью 2 л, за крывают их ватной пробкой и взбалтывают (числом колебаний 145 об/мин) при 30°С. Через 1 час добавляют в каждую колбу по 100 мг

2-метил-3-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5(10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-диона, взбалтывают еще 48 час.

Этот не описанный до сих пор исходный продукт ириготовляют известным способом

следующим образом: 6-метокси-7-метил-тетралин окисляют хромовой кислотой в 6-метокси7-метилтетралоне-1 (т. пл. 102-104°С), из которого после реакции с Гриньяровским соединением, с винилом-бромидом магния и последующей конденсации полученного «висколя, посредством 2-метилциклоиентандиона-1, 3 получают 2-метил-3-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5(10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-дион (т. пл. 101 -103 °С).

Затем соединяют исходные смеси, ферментации, экстрагируют их дважды 2 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт в вакууме при температуре ванны 45 °С, очищают остаток хроматографией препарата в тонком слое

(пример 1,а) и перекристаллизовывают продукт из изопропилового эфира.

Получают 2-метил-3-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-14а-ол-17-он; т. пл. 135-137°С;- ag j-47,8° (с 1, диоксан).

Согласно NMR-спектру гидроксильная группа а-постоянная относится к 13р-метиловой группе.

Пример 25. Получение 4-метил-З-метокси8(14)-секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17рол-14-она.

30 л суспензии Saccharomyces uvarum (CBS 1508)-сухого порошка (пример 20) перемешивают в бродильном чане из нержавеюшей стали при 30°С (число Колебаний 200 об/мин) и аэрируют 300 л/час воздуха. Добавляют 3,0 г 4-метил-3-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5(10),9(11)-эстратетраен-14, 17-диона, растворенного в 800 CMS этанола.

Этот не описанный до сих пор исходный продукт получают следующим образом: 5-метил-6-метокситетралон-1 вводят в реакцию с

Гриньяровским соединением посредством винила-хлорида магния и полученный при этом соответствующий «винол конденсируют посредством 2-метилциклопентадиона в 4-метил-З-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5(10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-дион (т. пл. 154-155°С).

Затем перемащивают в течение 48 час с аэрацией и 60 час без аэрации. Экстрагируют, как обычно, метилизобутилкетоном, сгущают экстракт, отделяют остаток хроматографией препарата в тонком слое и перекристаллизовывают полученный сырой продукт из изопропилового эфира. 167-168°С; а -43,6° (с 1, диоксан). Согласно NMR-спектру гидроксильная группа Рпостоянная относится к 13р-метиловой группе П р е дм е т изобретения Г. Спосо-б .получения оптически активных антинодов ряда стероидов, отличающийся тем, ,что соединение обш,ей формулы где С обозначает оптически неактивный атом углерода, а Q - группу-СН2-СНа- или -СН2-, X - водород, галоид, карбоксильную группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный радикал с 1-4 атомами углерода, который дополнительно быть замещен галоидом или гидроксильной группой, аминогруппой или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, Y- остаточную часть секостероида, включая кольца А и В, а также его функциональные производные по кетогруппам, подвергают ферментативному превращению, например, с микроорганизмами или выделенными из них ферментами. 2. Способ получения оптических активных антиподов ряда стероидов, отличающийся тем, что соединение общей формулы I I Y-Cгде С обозначает оптически неактивный атом углерода, Q-группу или -СНо-, X-водород, галоид, карбоксильную группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный остаток с 1-4 атомами углерода, который дополнительно может быть замещен галоидом или гидроксильной группой, аминогруппой или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, Y-остаточную часть секостероида, включая кольца А и В, подвергают ферментативному восстановлению, например, с микроорганизмами, как грибы, дрожжи, бактерии или с выделенными из них ферментами.