Способ выделения эндонуклеазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/10 

Изобретение относится к биологии а именно к способам получения ферментных препаратов.

Известен способ получения эндонуклеаэы, заключающийся в том, что целевой продукт высаливают из культуральной жидкости Serratia marcescens с помощью сульфата аммония с последующими хроматографией раствора на смоле Амберлит , обессоливанием на биогеле Р-6, хроматографией н смоле Сефадекс А-50 и концентрированием раствора фермента.

С целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты хроматографию осуществляют на полистирольной анионообменной смоле типа АВ 17.

Способ выделения и очистки эндонуклеаэы из культуральной жидкости Serratia marcescens штамма В 10М1 и 10 осуществляют следующим образом

Выращивание проводят по известной методике. Для этого 2 л культуральной жидкости, содержащей 300 ед. акт./мл эндонуклеазы (за единицу активности эндонуклеазы принимают прирост оптической плотности в кислоторастворимой фракции чд 1 единицу оптической плотности, измеренной при 260 нм, за 20 мин при 37°С), 0,1-0,2% от активности эндонуклеазы ФМЭ и 1-2-% от активности эндонуклеазы ФДЭ, центрифугируют, к супернатанту добавляют (КНц) SOt, до 40% насыщения и смесь

снова центрифугируют. Осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют (NHi,), SOif до 80% насыщения и смесь центрифугируют. Осадок собирают и растворяют его b 30 мл 0,05 М трис-НСг, рН 8,2, 0,005 М MgCIj. Затем раствор фермента центрифугируют, нерастворимый осадок отбрасывают. Выход эндонуклеазы по активности составляет 80-90%. I .

Супернатант, содержащий около 3 белка, 5000000 ед.акт. эндонуклеазы 0,1% ФМЭ и 0,2-0,5% ФДЭ, наносят на колонку с анионообменной смолой ЛВ 17x2 в фосфатной форме, уравновешенную 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5. Фермент не сорбируется на смоле и элюируется 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5, в объеме 500 мл. Пигменты, балластные белки, а также фосфатаза и фосфодиэстера,за задерживаются на анионообменнике Выход фермента по активности составляет 80-90%.

Раствор фермента концентрируют ,при упаривании на ротационном испарителе при 30°С до объема 100 мл.

В результате очистки получают раствор фермента, содержащий около 100 мг белка, 4000000 ед.акт, эндонуклеазы, около 0,01% ФДЭ и не более 0,001% ФМЭ. Общий выход фермента по активности составляет 60-70%. В ходе очистки .активность фосфатазы и фосфодиэстеразы уменьшается в 100 раз.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЭНДОНУК- ЛЕАЗЫ из культуральной жидкости Serratia marcescens путем осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты, хроматографию осуществляют на полистироль ной анионообменной смоле типа АН 17.