Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости SеRRатIа маRсеSсеUS Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 

113

Изобретение относится к области получения ферментов, в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеаэы. Эндонуклеаза применяется в молекуляр- ной биологии, биоорганической хинин, а также в ветеринарии.

Целью изобретения является сокращение длительности процесса, повышение выхода и чистоты целевого про- дукта. Эндонуклеазу выделяют иэ куль- туральной жндкости ВКПМВ-2379 за одну стадию с поношью лнгандообменной хроматографии на хелатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксус- ной кислоты (ИДК), заряженные ионами Си. Получение таких сорбентов описано в работе, Общая формула

ОН

I /

P-0-CHi-CH-CH -N

CHjCOO

Си,

е

CHjCOO Р - органический носитель

20

25

OR I

Р, -0-Si-(CH4),-O-CH4-CH-CH,

./

СН,СО(Г 30

о/:.

где Р - неорганический носитель.

Метод лигандообменной хроматографии основан на способности белков образовать комплексы с ионами переходных металлов, В процессе комплек- сообразования участвуют некоторые функциональные группы аминокислотных остатков поверхности белков, преиму- цественно имидазольные и тиольные Стационарная фаза представляет собой хелатные сорбенты, заряженные ионами переходных металловi которые взаимодействуют с разделяемыми соединениями путем образования координационных связей. В отличие от других видов хроматографии в зтом процессе сорбци белков мйжет происходить в присутствии высоких концентраций солей, неионных детергентов н некоторых органических растворителей, что позволяет выделять фермент непосредственно из культуряльной жидкости.

Оказалось, что при рП 6,5-6,6 из культуральной жидкости спрГ5ируется

5

0

5

0

5

0

5

0

5

преимущественно зндонуклеаза, а прочие белки остаются в растворе. Поэтому при выделеИНН фермента рН культуральной жидкости доводят до 6,5-6,6.

Сорбцию эндонуклеазы на хелатном сорбенте проводят на колонке с соот- ношеннем белок:сорбент«6 ед. см при скорости 15-20 мл/ч или в объеме с соотношением белок:сорбент 10-12 ед. во После промывки хелатного сорбента исходным буфером 0,1 М Na- ацетатным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,3-0,5 М NaCl, зндонуклеазу десор- бнруют с выходом 65-95Z тем же буфером, но с рН А,7-5,0. Наличие в используемых буферах 0,3-0,5 М NaCl обеспечивает подавление ионообменных взаимодействий. Использование более высоких концентраций NaCl нецелесообразно.

Пример 1.КЗмл ИДК-агаро- зы (29 1 молей/мл), заряженной ионами Си н промытой 0,1 М Na-ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М NaCl, добавляют 30 мл культуральной жидкости (7,5 ед. А дд/мл и 7400 ед. акт/мл) и рН 6,5 и перемещивают при комнатной температуре на качалке в течение 0,5 ч. Переносят в колонку и со скоростью 17 мл/ч промывают 0,1 М Na- ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М NaCl, до отсутствия поглощения при 280 нм. Десорбируют эндонуклеазу тем же буфером прн рН 5,0. Выход по активности 95Z, степень очистки 50 раз, удельная активность 182000 ед. акт./мл белка.

Пример 2. На колонку, содержащую 1 мл хелатного сорбента ИДК- тойоперла HW-55 (36 мкмолей/мл), уравновешенную 0,1 М Na-ацетатным буфером рН 6,6 с 0,3 М NaCl со скоростью 15 мл/ч наносят 10 мл кул ьту- ральной жидкости (5, ед. Aiao/мл и 5600 ед. актУмл) с рН 6,6, отмывают 0,1 М Na-ацетатным буфером рН 6,6, содержащим 0,3 М NaCl до отсутствия поглощения прн 280 нм. Десорбируют зндонуклеазу тем же буфером при рН 4,7. Выход по активности 80%, удельная активность 200000 ед, акт./мг белка.

Пример 3. Аналогично примеру 2, но в качестве хелатного сорбента используют ИДК-смлохром (19 мкмолей/мл). Выход по активности 63Z, удельная активность 100000 ел. акт./мл белка.

Пример 4. AtranorHMHO примеру 2, но сорбцию фермента проводят при рН 6,0, а десорбцию при рН 5,5. Выход по активности 30%, удельная ак тивность 150000 ед. акт./мг белка.

Пример 5. Аналогично примеру 2, но сорбцию фермента проводят при рН 8,0 в 0,005 М трис-НС буфере содержащем 0,5 М NaCl, а десорбцию при рН 4,0, О,I М Na-ацетатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl. Выход по активности 28%, удельная активность 60000 ед. актУмл белка.

Таким образом, проведение процес- се сорбции нуклеазы на хелатиом сорбенте в объеме позволяет значительно сократить время выделения фермента до 6-7 ч и с выходом 65-95Z получить препарат, содержащий не менее нуклеазы (определяют сканированием гелей после электрофореза).

Формула изобретение

Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеаэы из культураль- ной жидкости Serratia marcescene штамма ВКПМ В-2379 с использованием методов хроматографии, отличающийся тем, что, с целью щения длительности процесса, повышения выхода и чистоты целевого продукта, выделение и очистку проводят непосредственно из культуральиой жидkocти лигандообменной хроматогрв- фией на хелатиых сорбентах, содержащих иминодиуксусные группировки, заряженные ионами Си , при этом сорбцию ведут при рН 6,5 - 6,6, а десорбцию при рН А,7 - 5,0 натрий ацетатиьм буфером, содержащим 0,3 - 0,5 М хлористый натрий.

Изобретение относится к области получения ферментов , в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеазы. Целью изобретения является сокращение длительности процесса, повышение выхода и чистоты целевого продукта. Эндонуклеазу выделяют непосредственно из культуральной жидкости за одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на халатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксусной кислоты, заряженными ионами Си. Сорбцию эндонуклеазы проводят на колонке или в объеме. После промывки хелатного сор- бента исходным буфером 0,1 М Na-аце- татным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,3- 0,5 М NaCl, Эндонуклеазу десорбируют с выходом 65-95% тем же буфером, ио с рН 4,7-5,0. 1 табл. § (Л

Сопоставительная таблица

Предлага