Способ получения антибиотика Советский патент 1976 года по МПК C12D9/14 

вещест-ва отфильтровывают центрифугируют, а из фильтрата или фугата а«тибиотими выделяют методо,м акстракции адсорбции.

Для адсорбции используют такие адсорбенты, ,как уголь, силикагель, окись алюминия, .микрокристалличеокую целлюлозу или ионнообменные смолы.

АдсорбирОВанный антибиотик или его соль элюируют растворителем. При иопользова«ии 3 .качестве растворителя муравьинокнслого aMiMOHHH ,илИ ацетата натрия антибиотик выделяется в виде аммиачной или натриевой соли.

Микроорганизм Streptomyces clavuligerus .выделяют из образцов верхнего слоя почвы при суспендировании их в стерильной дистиллированной воде с последующим распределением суспензий на агаре. После посева на агар культуру выдерживают при 25-35° С в течение нескольких дней. В -конце ивкубацион«ого периода колонии МИ1Кроорга;низ,ма, вырабатывающего ант1ибиотик А 16886, .переносят стерильной платиновой петлей в косой агар. Затем его выдерживают -в термостате до образования .колоний для посева в оличестве, достаточном для получепия антибиотика А 6886.

Использованный ал тиомицей трудно классифиц1иро,зать в роде Streptomyces ввиду не типичной .морфологии. По этой причине микроорганизм считается новой разноаи.диостью и получил название Streptomyces clavuligerus.

Этот вид .образует хорошо ;мицелий из коротких Симпоидально разветвленных воздушных лиф. Образуются булавовидные боковые ветви со опорами от одной до четырех в (каждой. Конидии в субстрате не образуются.

Методом электронной микрографии были обнаружены с.поры с гладкими стевками. Препараты клеточной стенки содержат L-изомер диаминоп1имел1иновой кислоты и глицин, кроме основных составных частей, аопарпиновой и глутаминовой кислоты « алаии.на. В массе споры серого цвета, а первичный мицелий окрашен от светло-желтого до желтовато-коричневых тонов. Растворимый пигмент не образуется. Оптимальная температура 26-30° С. При 37° С роста нет. По Морфологии эта 1культура шохожа на некоторые штаммы Thermomonospora и Micnomonospora.

Новый микроорга.низм хранится в коллекции культур службы агрикультурных исследова1ний министерства сельского хозяйства США, Пеория, штат Иллинойс, 61604: под №. РР3585.

Характеристика Streptomyces clavuligerus 3585 да.на в приведенных н-иже табли.цах.

В таблицах цифры в скобках означают серии цветОВ Треснера и Бакуса, а также цветовые группы Моерца ж Пауле и подчер.кнуты табличные обозначения цвета.

Таблица I

Наблюдавшиеся

Характеристика свойства А 16886

Морфология

Сгюрофоры получены на воздушном минелнн и состоят из сети коротких си.мноидально разветвленных гнф.

Обычно па коротких булавообразных ветвях образуется 1-4 споры.

Размеры снор 0,34-0,85 X 0.85 - 1,5 мкм. Средине размеры снор 0.64 X 1,5 мкм.

На электронных микрограммах видны гладкостенные сиоры. Сиоры не образуются в мицелии субстрата.

Характеристика

Рост оби,1ьный, серовато-желтый культур по 1SP (I2K3); обильный воздушный минелпй, темно-серый (СЗ)Ь (21В1); .N 2 (агар, сорастворимый ингмснт отсутствует. держащш дрожжи и солодовый экстракт)

Умсре1Н1ЫЙ рост, светло-желтый

1SP № 3 (агар с овсяко мукой) (11С1), значительный воздушный .мицелий белого цвета (W) в (27А); растворимый пигмент отсутствует.

1SP Л9 4 (неоргаОбильный рост, серовато-желтая (12В2); у.меренный воздуи ный ническая соль - крахмальный мицелий, серый (СУ)2 Fe (45А1); агар) растворимый иигмеит отсутствхет.

1SP Кч 5 (глицеХороший .рост, светлый желтоватозеленый (1DB1), хороший воздуи рино-аспаргипоаый агар) ный мицелий, белого цвета (V) а; растворимого иигмеита нет.

Томатная иаста -

Об-нльный рост, серовато-желтый агар с овсяной (11Е4); у.меренный воз.аушный мимукой, светлый, серовато-оливковый (GN, 1 -V2ig (21В1); растворимый пигмент отсутствует.

Агар Эмерсона

Обильный рост, светло-желтый (НС1); скудный воздушный мицелий, растворимый гшгмент отсутствует.

Агар Беннета

Обильный рост, светло-желтый (1112); обильный ;БОздушный мицелий, темный, серовато-зеленый (GN) 24-/2 ill (23АЗ); растворимый пигмент отсутствует.

Агар Чаиека

Скудный рост.

Глюкозо-аснаргнУмеренный рост, светлый желтовановый агар то-зеленый (10В1); хорошнй воздушный мицелий (N) b (27.Л1); растворимый пигмент отсутствует.

Тироизиновый

Умеренный рост, светло-желтый агар (10В2); у.ме.ренный воздушный мицелий, желтовато-серый (GI) 2dc (10.Л2); растворимый пигмент отсутствует.

Питательный

Хороший рост, светлый, желтоватоагарзеленый (10В1); разбросанный воздушный мицелий, белый; растворимый нигмент отсутствует.

Обильный рост, светлый; желтоватоЯблочно-кислыйзеленый (10А1); хороший .возду икальцнйный мицелий, белый (W) а. Продолжение табл Наблюдавшиеся Характеристика CBOiicTBa CBoiicTBa Не сверт)1вяет, ироисходит сс ленио через 17 дней. Нитраты Не восстанавливает. Желатин Не разжижает. Реакция роста на рН 5,0-6,0 оптимальный преде изменение рН роста; при рН 7,5-8,5 ироис рост, но споры не образую Образоваиие мелаиииа Пелтоно-железный he ироисходит. агар и триптондрож/кевоГг экстрактОптимальная тем- Нрн те.миературе 26°-30° С хо рост н сиорообразоваиие, пература 37° С н выше рост не проис Основные комлоL, 1 - диамииоин.мелиновая ки ненты гидролитлицин, глуташиювая кисло зата целых клеиартнновая кислота, алаиип ток. В табл. 2 показаны результаты опыто утилизации углерода, проведенных на низме NRRL 3585. В таблице применены дующие обозначения: - Рост и утилизация Рост и утилизация не происходят ( + ) Вероятная утилизация (-) Сомнительная утилизация. Таблиц Утилизация углерода NRRL3585 Соединенж Реакция р Утилизация углерода: Ь-.,иноза Рамноза Фр кгоза D-Ксилоза Мелезитоза Раф.иноза Декстроза Целобиоза Л1альтоза Сахароза Целлюлоза Ннозит лишит Глута.мицат иатоня Как указывалось вы.ше, антибиотик А можло лолучать при выращивания NRRL В .качестве .питательной среды для п ния антибиотика А 16886 .можно исполь различные среды, однако ми.кроорганязм собен иапользовать только нем ногие ис ки углерода в искусственных условиях щивания. Специалиста в этой облас вестно, что микроорганизмы в сложной могут иапользовать та«ие источники у а, которые в Искусственных условиях не используются. Для экономически выгодного олучения ма коимального выхода антибиотика А 16886 и легкого выделения его предпочТ1итель: о использовать простые 1питателы1ые среды, та,кие ка;К крахмал глю1козы, глицерин, мелассу, декстрин и т. п. При .культивировании Streptomyces clavuligeriis -образуются но.вые антибиололичеохпе вещества, названные ависорами А 168861 и у 1688611 или фактора.ми I ил.и II. Соли эглх антибиотиков легко -получаются при реакцлл их с соответствующими кислота.ми или основания.ми. Антиб1И.оти|К А 16886 и его соли обладают способностью разрушать баа терпи, а также глистог.он.нЫМ действием. Способ .получения антибиотика А 16886 преду:матри-вает выращивание Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 в питательной среде, содержащей усвояемые источни,ии углерода, азота И неорганических солей, в аэробных условиях глубинным методом до на.коиления з питательной среде значительного (количества антибиотика. Аптибиотичеокое вещество А 168861 представляет собой первич(Ную аммониевую соль- аморфное .вещество не совсем белого цвета, темиература размягчения которого 190 - 300° С. С повыщением температуры изменяет цвет до темно-коричневого. Легко растворим в воде, мало растворим в низших алканолах и нерастворим в ацетонитриле. Вещество амфотерное и имеющее тит.руемые груп.пы рКа, 41; рКа., 5,2; рКд, 9,3; -рКа. 10,5. Молекулярный Вес его равен .примерно 530. Примерный состав, %: углерод 40,26, водород 5,81, азот 33,37, кислород 7,2. Удельное вращение - (а) 153,6° ( вес/объем в воде). Смесь его с минеральным маслом имеет следующие характерные полосы поглощения в .илфра.краспой области спектра: 3,10; 5,68; 6,30; 6,60; 7,20; 7,60; 8,33; 9,35; 9,60; 9,85; 11,60; 12,90-MOi. Антибиотическое вещество А 1688611 представляет собой а.ммиачпую соль - пушистое аморфное вещество, ее совсем белого цвета с температурой размягчения 190-300°С, с изменением цвета до темно-коричневого. Хорощо рВСтворим В ВОде. Малораст.ворцм в пизщих алка нолах И нерастворим s ацетонитриле. Это вещество амфотериое и имеет титруе-мые груп.аы рК,. 4,0; рКа, 5,3; рК,., 9,2; рКа 10,5. Мол. .вес 526. Химический состав, вес. %: углерод 41,01; водород 5,64, азот 15,75, кислород 29,28, сера 7,04. Удельное вращение (а)а25+:86,2° (С 1 % вес/Объем в воде). Смесь его с минеральным маслом имеет следующие xapaiKTepiHbie полосы поглощения в инф.ра,крас1ной области Спектра: 3,15; 5,70; 6.30; 7,22; 7,64; 9,05; 9,4,0; 9,65; 11,60 мкм. Содержание фа ктора I в ан™би.от1И|Ке 16886 составляет 1-99%, а фа.ктора II - 99-1%. Примеси составляют 1%, поэтому они не были идеи ти фи.цир ОБ аи ы.

При проведении качествеиного анал.иза смеси моноаммиачной соли фактора I и II дали ПОложИтельиые результаты € |И:И|Нгидрином, ло ПаН-Дутшеру, Бенедикту, Молиту, Фелингу, С дансилхлориаам, йодом, хлоридом железа. Отрицательные результаты были .-получены с биуретОМ и реагентом СакагушИ. Смесь моноамм:иачных солей факторов I ti II, высушенных ари .комнатной температуре в вакууме над безводйым хлоридом кальция в течение 15 ч, обладала способностью вращать плоскость лоляр«зации (а)в2 + 110,Г (С 1% sec/объем IB воде). Омесь аюноаммиачных солей факторав I и II стабильна при рН 3-8 и тем пературе 6° С в течевие 8 длей. Относительно стабильна при рН 3-8, температуре 25° С в течение 2 дней. Биологичес,кая активность смеси медленно терялась при рН 3-8 и темлературе 25° С. Налоловилу а ктивность уме: ьшалась через 4 дня.

Элементарный анализ моноамМ1иачных солей А 168861, высушенных в над пятиакисыо фосфора лрл темлер атуре 80° С показал, что эта соль содержит 5,02% Метоксила. Присутствие .метоксильной группы подтвердилось синглетом лри 3,53 мг/л cneicrpa ядерно- магнитного резонанса. Прл определении методом Ван-Слойка установили, что моноаМмиа Ч;ная соль фа1ктора I содержит 5,3% азота aiMHHa. По спектру ядерно-магнитного резонанса для фактора I в DjO установили следующие характеристики: 5,19 мг/л (1Н, синглет); 4,94, 4,74 (2Н, АВ квартет, Гц); 4,0---4,2 мг/л (1Н, .мультиплет); 3,68, 3,32 мг/л (2Н, АВ квартет, Гц); 3,53 мг/л. (ЗН, .синглет); 2,6-2,4 мг/л (2Н, мультиплет); 2,1 -1,6 мг1л (4Н, мультиплет).

На спектре логлощения -в ультрафиолетовой области антибиотика А 168861 в водном растворе В-идны максимумы поглощения при 242 мкм (, 132) « лри 264 мкм ( 1см 65); измеряли также круговой дихроизм в водном растворе .и установлен лоложительный эффект Коттона пр:И 263 мкм и отрицательный эффект Коттона при 236 мкм.

При хроматография на бумаге амМиачной соли антибиотич а А 168861 (с лрименением бумаги Ват.мал № 1) лолучили значение R/ 0,41 в системе р:астворителя лропанол - ацетонигрлл - вода при объемно отношении 1:1:1.

Биоавтографы были лолучены при помещении хроматограм1мы ла агаровые пластин1кл, на которые был посеян Salmonella gallinarum в :качестве испытуемого микроорганизма.

При хроматографии в тонком слое антибиотика на силикагелевых лластилках в 70%-ном водно-м ацетонятриле с опрыскиванием нингидрином ,в качестве индикатора, Rf 0,51; ла .целлюлозных лластиеках в системе ацетонитрилмзолроланол--вода R.- 0,36.

Аминокислотный анализ .антибиотика А 168861, проведенйый по методу Спакмава - Мура и Штейна локазал два лика, соответствующме реа1кции нингидрина; один из них элюировали идентично глицино.м (0,61 ммоль/ мг), другой элюяровади непосредственно перед применением глицина и иденпифицироваЛи ка.к а-ам,иноадилиновую (КИСлоту (1,97 ммоль/мг).

При электро.метричеоком титровании моноам.миачной соли антибиотика А 16886 Id в 66%-iHOM .водном растворе диметилформамида

при значении рН 7,7 установили лрисутствие четырех титруемых гру.пл: рКа, 4,4; рКаг 5,7; рКаз 9,6 и рК%., 10,4.

При значении рН равном 6,8 получили соответствующие значения рКа, 4,0; рКа, 5,3;

рК,, 9,2; рК ., 10,5.

Анализ фактора II .в системе ядерно-магнитного резонанса показал отсутствне сигналов, характерных мета:ксильных грулп в :противололожность фа,ктору I.

CneiKTp ядерно го мапн итно-резонанса А 1688611 В D2O дал следующие характеристики: 5,75лг/л (1Н, дублет, / 5 Гц); 5,15мг/л (Ш, дублет, 1 5Гц); 4,90-4,68 мг/л (2Н, АВ квартет, ); 3,9-3,7 мг/л (1Н,

мультиплет); 3,69-3,39 мг/л (2Н, АВ квартет, Гц); 2,6-2,3 (2Н, мультиплет); 2,1 -1,5 (4Н, мультиплет).

При анализе методом Ван-Слай.ка установили, что в антибиотике А 168861 содержится 5,1 % азота.

Ультрафиолетовый спектр юоглощепия антибиотика А 1688611 tB водном растворе аоказал Ма;ксимум поглощения при 260 мкм

№}см 148). При измерении .вого дихроизма в водном растворе установили лоложительный эффект Коттона при 258 мкм и отрицательный эффект лри 228 мкм.

В результате хро.матографи.и на бумаге

(ватман № 1) фактора II лолучили значение R/ 0,33 в системе растворителя пропанол - ацетонитрил - вода, при объемном отношении 1:1:1. Биоавтогр.афы получ.или при HOLM ещении бумажной хроматографии .на агаровые лла.стинки, засея.нные Salmonella gallinarum )В качестве испытуемого организма.

При хроматографии в тонком слое моноаммиачной соли антибиотнка .на .сили1кагелевых лластинках в 70%-ном .водном ацето нитриле с

опрыскиванием пингидрином лолучили значение Rr 0,42; на целлюлозных лластин.ках в системе ацетонитрил : изолропанол : в-ода 1 : 1 : 1, R/ 0,29.

Аминокислотный анализ 1кислого лидролизата антибиотика -методо-м Спа.кмана - Мура - Штейна обнаружили в начале только оди.н niHiK, соответствующий реакции нингидрина, его элюировали непосредствен.но леред ,прим.энением глицина и идентифицировали

как а-аминоа.дипиновую кислоту (2,1 ммоль мг). Однако имелись такнсе другие маленькие niHKH, (Которые элю-ировали глицином. Следующий образец анализировали та.ким же методом и установили величчгну 2,1 лглоль/лг и

0,13 ммоль/мг соответственно. Иоследовадаия .моноаммиачной сэлгл антибиотика .методами хроматографии на бу-маге и хрОМатогр.афии в тонком слое в разных системах растворителя дал1И следующие результаты. Значения R, Система растворителя Хроматографии на бумаге Фактор I Фактор II Этанол - вода (80 : 20) п 1,5% хлорида натрия; бумага, пропитанная 1 н. раствором сульфата натрия. 0,33 Бутанол, насыщенный воИеподвижНепрдвиждой .ный Бутанол, насыщенный водой и 2% п-толуолсульфОКИслотыЛ1етплнзобутплкетон, насыНеподвижНеподвижщенный водой ный 1ный Метилизобутилкетон, насыщенный водой и 2% НеподвижНеподвижп-толуолсульфокислотыный Мети л изобутилкетон, насыщенный водой п 2% пиКгподвкжНеподвижперидинаНеподвиж- НеподвижАцстонитрилПроианол-ацетон итрил- метанол-вода (4:3:2:1) Пронанол-пиридин-уксусиая кислота-вода (15: 10:3: 12) Проианол-нирндин-уксусная кислота-ацетонитрил-вода(45 : 30 : 9 : 40 : 36) Бутанол-уксусная кислота-вода (3:1:1) Этил ацетат-уксусная кислота (3:1: 1) Проианол-вода (70 : 30) . цетонитрил-вода (70 : 30) Вода-этанол-уксусная кислота (70 : 42 :б) Хроматография в тонком слое Ацетонитрил-вода (7 : 3) на целлюлозных пластинкахАнтибиотик и его соли задерживают рост iKaiK грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Прекращение роста микроорганизмов при минимальной концентрации (наблюдалось в тече.ние примерно 24 ч. Антибиотик и его соли иригодны для борьбы € инфе1кцией. Оии обладают а.ктивностью в ни во в а Д в ю щ пе р в в 40 1 с п т м н а 4 р ж п м в отнощении бач терий, патогенных для растей. Пример 1. Приготовление антибиотика встряхиваемых склянках. Культуру Streptomyces clavuligerus 3585 форме спор выращивают «а твердо.м косом аре, имеющем следующий состав, г: Декстрин10,00 Дрожжевый экстракт1,00 Гидролизованиый ,казеи,и («Н-Z типа амина «А фирмы Шеффилд Кэмикал Компани)2,00 Мясной экстракт1,00 Агар Меера (иромытый трижды)20.00 Де--гон;изированная вода 10,00 оба,злением гидроо1ки,си натрия устанавлиют рН среды 7,0. ВыращиВапие осуществлят в течение 4-б дней при 30° С. 1 мл выраенной Культуры вводят в виде .водной суснзии в 100 мл вегетативной среды при Н 6,7 следующего состава, г: Глюкоза15 Соевая .мука15 Твердые вещества вымоченной кукурузы5 Карбонат кальция2 Хлорид натрия5 Деионизированная вода, л1 Вегетативный посевной материал встряхиют в течение 24-28 ч при 30° С, при одноеменном вращении аппарата со скоростью 08 обмин. На 100 мл приготовлениой среды става, г: Соевая мука Казеин Нитрат натрия Гликозный сироп (50% глюкозы) Водолро.водная вода, л редварительно стерилизованной при 120°С в ечение 30 мин, по,мещеи1иой в колбе Эрленейера е:М|КОСтью 500 мл, высевают полученый 5%-ный вегетативный посев;ной материл, после чего колбу встряхивают в течение 8-72 ч при одновременном вращении аппаата со скоростью 250 об/мин. Во время броения среду аэрируют стерильньгм воздухом ри его расхаде 0,4 об /мин. Пример 2. Антибио-лик получают по приеру 1, используя среды следующего состаа, г: Раст-воримые вещества отходов винокуренного завода (Нардисел)

Соевая мука

(Нутр.исой 200 Д) Арахисовая мука Меласса с патокой Овсяная мука Глицерин Водопроводная вода,

Пример 3. Антибиотак получают, как в римере 1, но используют следующую питаельную среду, г:

Мука ИЗ семян хлолчатлика 20,0

Глицерин10,0

Глюкоза5,0

Водопроводиая вода, л1,0

П р и м е р 4. Приготовлениеаптибиотика а среде следующего состава, г:

Глюлоза20,0

РаствОримый крахмал10,0

Пептоп ВильсОПа 15930,0 Гидролизованный казеан («Н-Z типа амина «А фирмы Шеффилд Кэмикал

Комшаяи)4,0 Шестиводный сульфат эд.агния 5,0

Меласса с латокой5,0

Карбонат натрия2,0

Водопроводная вода, мл1100

Пример 5. Приготовлениеантибиотдака а среде следующего состава, г:

Гл/ИЦерин20,0

Соевый лептон5,0

Нитрат .кальция2,0

Х.лор(Цд натрия0,5

Падрисол3,0

Водоправодная вода, л1

6. На косой агар следующего

Пример cocTaiBa, г:

Декстрин10,0

Дрожжевой экстракт1,0 Гидролизованный казеин

(«Н-Z TiHwa амина «А,

Шеффилд

Компани)2,0

Мясной э,кстра кт1,0

Шестн-водный хлорид кальция0,01

Агар Меера ,20,0

Деиониэираванная вода, л1

при рН 7,0 установленного с помощью гидроокиси натрия, засевают культуру Streptomyces clangligerus 3585 « выдерживают при 30° С в течение 7-10 дней. Выращенную таким обра.зО(М культуру по,мещают в 2,0 мл стерильной .быньей сыворопкги. Затем 1 мл полученной суалензии переносят в лиофиловую трубку .и высущивают лри низкой темлературе до образования таблеток. Полученные таблет12

ки помещают н,а питательную щего состава, г:

Глицерин

Сахароза

Зерна сои

Янтарь BYF 300

Тр иптон

Диофосфат калия

Водопроводная вода,л

при рН

среды, установленной гидроокисью натрия.

При м е р 7. Приготовление антибиотика на опытной установке.

В бродильный чан из нержавеющей стали ем.костью 40 л з агрузили 24 л среды следующего состава, г:

Антифом А (присадка, лр&пятствующая вспениванию, фирмы Дау Корнинг Комлани)

КрахМ.ал

Надрисол

Мука

Глицерин

Амин А

Шестиводный сульфат железа Хо л од Н а я водоп р.ово д н а я

вода, л

Пер/воначальное рН 5,9 доводят до 6,5 добавлением 20 мл 5 н. раствора гидроо-киси натрия лри 120° С и давлении 1,05-1,26 /сг/сж в течение 30 мин. На приготовленную таким образоМ среду высевают культуру, полученную по лримеру 6. Процесс брожения протекает лри 30° С -в течение 66 ч при аэрации стерильным воздухом, подаваемым со скоростью 0,35 объем/объем/. и перемещивании механической мешалйой со скоростью вращения 420 об1мин. Конечное зн ачение рН 6,3.

При/мер 8. При.мерно 75 л бульона, (полученного ло примеру 7, Профильтровывают через Гифле Супер-Цел (диатомовая земля, выпускаемая /в продажу фирмой Джонс-Манвилл Продактс), в количестве 5 г/100 мл.

Фильтрат лропускают через колонну размером 9,5 X 130 см, наполненную 8 л угля (Питтобурт 12 X 40), со скоростью 60 мл/мин. Колонну лрО|Мыв.ают 10 л деиоцизирован«ой воды (рН 5,2) л 50%-ны.м водным ацетоном. Полученные отдельные фракции объединяют и в вакууме отгоняют ацетон. Затем снова ;пропус.кают через колонну, натолненную да уэксом i-XI. Коломну тромывают 10 л даионизировапной щоды и 0,1 М раствора.м муравьинокислого а.М.мония. Фракции объединяют и пролускают через колонну 9,5 X 100 см, наполненную углем, со скоростью 60 мл/мин. Колонну промывают водой |И элюируют смесью ацетона и воды в отношевии I : 4 со скоростью 60 мл/мин.