Способ получения антибиотика Советский патент 1976 года по МПК C12D9/14 

На питательной среде 4 растет обильно. Субстратный мицелий бледно-желтый. Обильный воздушный мицелий и белая споруляция. СветкО-коричневый лигмент отсутствует.

Яблач-нокислый кальций. Рост хороший. Субстратный мицелнй светло-желтого цвета. Воздушный мицелий уме1рен«ый и сноруляция бледно-желтого цвета. Растворимый пнгмент до наличия светлО-желтого цвета отсутствует.

Питательная среда Чалека. Рост хороший, субстратный мицелий светло-желтого цвета. Воздушный ,мицел«й блед-но-желтого цвета, споруляция. Растворимый .пигмент отсутствует.

Томатная ласта с оесянОй мукой. Рост обильный. Субстратный мицелий бледножелтого цвета. Хороший воздушный .мицелий и споруляция желтовато-серого цвета. Растворимый пигмент отсутствует.

Физиология

Хорошо растет и спорулирует при 26- 37°С. Не растет лри 43, 49 или 55°С. Снятое молоко не свертывает, наблюдается поверхностное кольцо роста. Желатин разжижает полностью после 21 суток. Легкое восстановление нитратов после 21 суток.

Питательная среда может быть любой, однако предпочтительными являются среды, которые содержат легко усвояемый источник углерода, такой как глюкоза, маннит, фруктоза, растворимый крахмал, декстрин, меласса, желтый сахар. В среду вводят источник азота, например, овсяную муку, мясной экстрат, гидролизированный казеин, замоченные зерна, дрожжевой экстракт, соевые бобы, пептоны (мясные или соевые).

В питательную среду могут быть включены минеральные соли, например, дающие ионы кальция, магния, натрия, калия, кобальта, хлора, сульфата или карбоната, и ростовые вещества, такие как дрожжи или дрожжевые экстракты.

В питательную среду добавляют также микроэлементы.

Микроорганизм растет при температуре 26-40°С, предпочтительно между 26-30°С, рН питательной среды находится в пределах 6,5-7,2. Образование антибиотика происходит от двух до пяти дней.

Небольшие количества антибиотика получают в колбах, а поверхностную культуру - в бутылках. Для приготовления больших количеств антибиотика выращивают культуру микробов в глубине аэробной питательной среды в больших резервуарах.

Чтобы избежать задержки в процессе производства антибиотика, используют вегетативную форму микроорганизма для посева в питательной среде в производящих резервуарах. Вегетативный прививочный материал микроорганизма вначале приготавливают путем инокуляции, а затем асептически переносят его в резервуары для получения в больших количествах. Для производства прививочного материала вегетативной формы может быть использована та же питательная среда, что и для получения антибиотика. Культуру микробов в глубине аэробной питательной среды продувают стерильным воздухом - 0,3 объема воздуха в 1 мин на 1 объем питательной среды. Концентрацию активности антибиотика в

питательной среде определяют во время ферментации путем тестирования образцов питательной среды на их подавляющую активность против роста известного микроорганизма.

При разделении и очищении антибиотика на активные компоненты А и В могут быть использованы различные методы, например, солевая экстракция, применение адсорбентов и колоночной хроматографии.

Активный компонент А, выделяемый из смеси антибиотика, представляет собой белую, кристаллическую смешанную натрийкалиевую соль, имеющую точку плавления 161-:165°С.

Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика не растворима в воде, слегка растворима в метаноле, растворима в простом эфире и в сложных эфирах, таких как метилацетат, этилацетат, в кетонах, таких

как ацетон и метилэтилкетон, в хлороформе, бензоле и толуоле.

Компонент А стабилен в растворе при величине ,0 и температуре до 27°С. Свободная кислота компонента А представляет собой белое кристаллическое твердое вещество, плавящееся при 97-99°С. Элементарный состав этой кислоты следующий: 63,31% углерода, 8,83% водорода и 28,03% кислорода.

Масс-спектральные данные компонента А указывают на приблизительный вес 834. Молекулярный вес натриевой соли составляет 874, поэтому молекулярный вес свободной кислоты равен 852.

Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика компонента В представляет собой белое кристаллическое вещество, плавящееся при 170-172°С. Растворимость и стабильность компонента В аналогичны образцам

смешанной натрий-калиевой соли компонента А. Кислотная форма компонента В - это белое кристаллическое твердое вещество с точкой плавления 122-124°С. Элементарный состав: 60,49% углерода, 9, водорода и

31,32% кислорода.

Молекулярный вес натриевой соли компонента В, вычисленный из данных по титрованию, составляет . Молекулярный вес свободной кислоты компонента В равен

855.

Новый антибиотик обладает ингибирующим действием на рост микроорганизмов, как бактерий, так и грибков, патогенных для животных и растений, и полезен при

подавлении роста таких микроорганизмов.

При испытании тестом дисков оба компонента антибиотика показЯоТИ видимые зоны ингибирования против следующих микроорганизмов: Bacillus зиЬ11И5, Mycobacterium avicem Sarcina lutea.

Компонент В при испытании в вирускультивируемой среде проявляет активность против вируса коровьей оспы, поливируса III, вируса комариной лихорадки Семлики, вируса герпеса и вируса гриппа Япония 305.

Антибиотик предотвращает развитие некоторых заболеваний растений. Препарат из с.месн компонентоз А и В при разбрызгивании эффективен против мучнистой росы бобовых растений н корончатого галла помидоров, nipn иримсионии на инфицированных растениях с помощью разбрызгивания или смачивания указанная смесь активна и против вирусных заболеваний растений - вируса южной мозаики фасоли и вируса карликовости маиса.

Антибиотик обладает также иасектицидной активностью. Например, при контакте с растворами компонента А или компонента В антибиотика при концентрации 100 частей на тысячу, гибель домашних мух достигает 88%, при концентрации 250 частей на тысячу - 99%.

Важным свойством антибиотика является его способность предотвращать развитие кокцидиоза у домашних птиц.

Антибиотик (и его компоненты) улучшает усвоение углеводоров у животных, т. е. повышает эффективность их вскармливания. Он влияет на состав свободных летучих жирных кислот в рубце, в частности увеличивает количество нропионата, доступного для обмена у жвачных.

Другим важным свойством антибиотика является способность образовывать комплексы с моновалентными катионами. В экспериментах по определению «онной специфичности компонент А показал специфичность к ионам калия и рубидия, в то время как сам антибиотик проявляет специфичность к ионам натрия и калия. Использование же ионноспецифичиых электродов является важлым во многих химических анализах.

Пример 1. Ферментация методом встряхивания.

Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и цоддерживают на косом агаре, имеющем следующий состав (г): Декстрин 70010

N-Z амин А2

Мясной экстракт1

Дрожжевой экстракт1

Агар20

Деионизированная вода1 (л).

Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой NRRL 3883 и инкубируют при 30°С в течение 4-6 дней. Снорулированный косой агар покрывают небольшим количеством стерильной деионизированной воды и осторожио соскаблив,ают, чтобы получить водную суспензию, содержащую споры, 1 мл полученной спороносной суспензии ис-. пользуют, чтобы инокулировать 100 .мл стерильной вегетативной питательной среды, имеющей следующий состав (г):

Глюкоза15

Соевая мука15

Замоченные твердые зерна5

СаСОз2

NaCl5

Водопроводная вода1 (л).

Инокулированную вегетативную питательную среду инкубируют 24-48 час при 30°С на обратном щейкере. Затем порцией (5 мл) полученной культуры пнокулируют 100 мл производящей питательной среды, находящейся в сосуде Erlenmeyer (емкость 500 мл) и имеющей следующий состав (г):

Соевая мука15

КазеинI

КаЫОз3

Сирой из глюкозы20

Водопроводная вода1 (л).

Инокулированную питательную среду оставляют для ферментирования на 42-72 час при 25 - 30°С в ротационном щейкере (250 об/мин).

Пример 2. Резервуарная ферментация антнбиот-ика.

Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и поддерживают на косом агаре, имеющем следующий состав (г):

Декстрин10,00

Дрожжевой экстракт1,00

|Казеин, гидролизированный

ферментами2,00

Мясной экстракт1,00

СаСЬ-бНгО0,01

Агар20,00

Деионизированная вода1 (л).

Раствором едкого натра рП питательной среды доводят до 7. После стерилизации паром (путем автоклавирования) в течение 30 мин рП питательной среды составляет 6,9. Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой NRRL 3883 и инкубируют при 30°С в течение 10 дней. Спорулированный косой агар покрывают небольщим количеством стерильной деионнзированной воды и осторожно скоблят для получения водной суспензии, содержащей споры.

Каждую косую среду используют для инокуляции щести сосудов (объем 250 мм), в каждом из которых находится 50 мл стерильной вегетативной питательной среды следующего состава (г):

Глюкоза15,0

Соевая крупа15,0

Замоченные зерна10,0

NaCl5,0

СаСОз2,0

Водопроводная вода1,1 (л).

Раствором едкого натра рП питательной среды доводят до 6,5, и она не изменяется